FL 1

Question 1

Ge exempel på de egenskaper vi vill mäta hos biomolekyler.

Answer 1

Storlek & form. 
Struktur. 
Laddning. 
Modififeringar.
Enzymatisk aktivitet. 
Mängd. 
Hydrofobicitet/hydrofilicitet.
Stabilitet. 
Halveringstid. 
Bindning. 
Renhet. 
Fluorescens.
Löslighet. 
Funktion (active site).

Question 2

Vad innebär kvalitativ analys? Ge exempel på frågeställning.

Answer 2

Kvalitativ analys innebär att man får ett ja/nej resultat. Ex. “Är vårt protein fluorescent?”.

Question 3

Vad innebär kvantitativ analys? Ge exempel på frågeställning.

Answer 3

Kvantitativ analys innebär att man får ett värde. Ex. “Hur mycket fluorescerar vårt protein?”.

Question 4

Vilka interaktioner berör spektroskopi?

Answer 4

Interaktioner mellan materia och elektromagnetisk strålning.

Question 5

Vad är elektromagnetisk strålning?

Answer 5

Elektromagnetisk strålning är en form av energi som ”uppstår” då fotoner uppvisar både våg- och partikelegenskaper = dualitet

Question 6

Vad innebär dualitet hos fotoner?

Answer 6

Att de uppvisar både våg- och partikelegenskaper.

Question 7

Vilken formel används för att beräkna energin?

Answer 7

E = hv = h * (c/lambda).

E är energi, h är plancks konstant, v är frekvens och lambda är våglängd. c är ljusets hastighet.

Question 8

Vad kan man mäta med spektrometri?

Answer 8

o	Absorbans 
o	Emitterad överskottsenergi (ex.
fluorescens).
o	Resonans och relaxation efter energiabsorption (ex. NMR).
o	Ljusspridning (light scattering).

Question 9

Vad påverkas i området med röntgen- och ultraviolett strålning?

Answer 9

Förändringar i elektrontillståndet främst.

Question 10

Vad påverkas i området med infrarött strålning?

Answer 10

Förändringar i rotation.

Question 11

Vad påverkas i området med mikro- och radiovågor?

Answer 11

Elektron- och kärnspin förändras.

Question 12

Vilken spektroskopi i ultravioletta och synliga spektrumet kan utföras?

Answer 12

o	Fluorescens-spektroskopi.
o	FRET.
o	Luminometri.
o	Circular dichroism (CD)-spektroskopi.
o	Ljusspridning. 
o	UV-Vis spektroskopi.

Question 13

Vad kan vissa molekyler göra i UV-Vis regionen? Vad händer med energin?

Answer 13

De kan absorbera fotoner vilket resulterar i att elektroner exciteras. Energin hos fotonen matchar energiskillnaden mellan grund- och excitationstillstånden.

Question 14

Vad kan man göra med absorbansen?

Answer 14

Beräkna koncentrationen med Lambert-Beers lag.

Question 15

Vad är kromoforer?

Answer 15

Molekylära strukturer som interagerar med elektromagnetisk strålning.

Question 16

Vilka kromoforer har proteiner?

Answer 16

Peptidbindningar och vissa aminosyror som tryptofan och tyrosin.

Question 17

Vilka kromoforer finns hos DNA/RNA?

Answer 17

Nukleotider.

Question 18

Vilka externa kromoforer finns? Vad används de till?

Answer 18

Det finns Cu2+ och BCA som används i BCA-assays samt Coomassie brilliant blue i Bradfords-assays för bestämning av koncentration.

Question 19

Vilken kromofor hos proteiner är lättast att upptäcka?

Answer 19

Tryptofan dominerar & det är lättast att mäta ett prov med mycket tryptofan. Man vill ha en hög extinktionskoefficient.

Question 20

Varför mäter man inte peptidbindningar vid dess högsta extinktionskoefficient?

Answer 20

Peptidbindningar absorberar bra vid 190nm men där absorberar även många andra ämnen vilket ger en låg specificitet. Generellt mäter man därför högre upp, kring 210nm eller vid 220nm där extinktionskoefficienten är mycket mindre, men bakgrunden är bättre för mätning.

Question 21

Varför är icke-aromatiska aa inte tillräckliga för mätning?

Answer 21

Icke-aromatiska aminosyror har väldigt svag absorbans och drunknar kring de andra kromoforer.

Question 22

Vad kan påverka extinktionskoefficienten?

Answer 22

o Protonering (pH, RedOx).
o Lösningsmedlets polaritet.
o Omgivande aminosyror/grupper.

Question 23

Hur kan absorbans användas för att kolla på struktur?

Answer 23

Om vi har tryptofan som pekar inåt mot kärnan (hydrofob miljö) hos en atom och denaturerar detta proteinet kommer tryptofan istället att peka ut mot lösningsmedlet istället vilket påverkar absorbansen kraftigt.

Question 24

I vilka våglängdsområdet mäter vanliga spektrofotometer?

Answer 24

175-600nm

Question 25

Vilka delar behövs i en spektrofotometer?

Answer 25

Vi behöver en strålkälla där ljuset som ska absorberas emitteras och lampa för visuellt eller UV-ljus. Speglar leder strålgången. Finns även en monokromator, ex. en prisma. En monokromator styr vilken våglängd som går igenom. Sedan går ljuset vidare mot kyvetten som innehåller prov. Passerar genom provet och detektorn följer och skickar värden till datorn. Man har även ett referensprov som man oftast mäter innan sitt prov det används för att fånga upp molekyler i lösningsmedlet som absorberar ljuset och därför mäter vi referens först och drar bort den absorbansen från provkyvetten. Detta leder till att vi endast fångar in den relevanta absorbansen.

Question 26

Vad brukar UV-spektrometri användas för?

Answer 26

Konc. bestämning av DNA/RNA/Protein.

Strukturella förändringar i proteiner.

Question 27

Vad måste vi veta för att kunna konc. bestämma ett protein (UV-abs)? Vrf är metoden inte exakt?

Answer 27

Extinktionskoefficienten som mäts från aminosyrasekvensen. Den teoretiska extinktionskoefficienten är oftast inte helt rätt, det är väldigt olika för olika proteiner. Noggrannheten i en sådan bestämning är därmed inte optimal.

Question 28

Fördelar och nackdelar med proteinkonc. bestämning med UV-absorbans.

Answer 28

Fördelar:
o Snabb metod.
o Knappt någon provhantering.
o Relativt enkelt och billigt instrument.
o Proteinet riskeras inte förstöras under analysen.
Nackdelar:
o Låg känslighet och noggrannhet.
o Smalt dynamiskt område.
o Sekvensberoende, ex. om inga eller få Trp finns.
o Vissa kemikalier (ex. DTT) och andra cellkomponenter (DNA/RNA) absorberar också.

Question 29

Vad är bradford assay?

Answer 29

Bradford assay innebär att man tillsätter Coomassie brilliant blue som binder till arginin och aromatiska aminosyror. Detta förändrar maxabsorbansen från 470 till 595nm. Bestämning sker med med standardkurva och interpolering.

Question 30

Fördelar/nackdelar med bradford assay?

Answer 30

Fördelar:
o Snabb metod.
o Mindre påverkan från olika kemikalier (ex. DTT).
o Inte lika beroende av Trp-innehåll jämfört med UV-absorbans.
Nackdelar:
o Vissa detergenter (ex. SDS) kan påverka.
o Har ett visst sekvensberoende.
o Kräver standardkurva och interpolering.

Question 31

Vad är BCA assay?

Answer 31

BCA-assay används allra mest för koncentrationsbestämning av absorbans-metoderna. Man tillsätter kopparjoner som binder in till backbone av aminosyror som chelaterar kopparjonen till enkelprotonerad. Kopparjonen reagerar med BCA som absorberar vid 562nm.

Question 32

Fördelar/nackdelar med BCA assay?

Answer 32

Fördelar:
o Snabb metod.
o Mindre sekvensberoende (men påverkas av Cys, Tyr & Trp).
o Mindre påverkan av detergenter som SDS.
Nackdelar:
o Reduceringsmedel kan påverka.
o Har ett visst sekvensberoende, men mindre än UV-absorbans och Bradford assay.
o Kräver standardkurva och interpolering.

Question 33

Hur brukar man mäta konc. i praktiken?

Answer 33

Man börjar ofta med uv-absorbans-mätning, får ett första resultat, en indikation på koncentrationen och går vidare med kolometrisk assay.

Question 34

Vad motsvarar A260nm = 1 ?

Answer 34

o 50 mg/ml ds DNA.
o 33 mg/ml ss DNA.
o 40 mg/ml ss RNA.

Question 35

Hur uppskattar man kontaminanter hos DNA/RNA med uv-abs?

Answer 35

Kvoten av A260/A280 används ofta för att uppskatta renheten av DNA & RNA.
Rent DNA: A(260nm)/A(280nm) runt 1.8.
Rent RNA: A(260nm)/A(280nm) runt 2.0.

Question 36

Hur uppskattar man kontaminanter hos protein med uv-abs?

Answer 36

A(260nm)/A(280nm) > 1 är en indikation på att proteinprovet är kontaminerat med DNA eller RNA. Vi vill alltså ha ett värde under 1!

Question 37

Hur tar man reda på smältpunkt med absorbans?

Answer 37

Dubbelsträngat och enkelsträngat DNA har olika ext.koef. vid 260 nm.
ssDNA har 0.027 (µg/ml) cm-1
dsDNA har 0.020 (µg/ml) cm-1
Högre extinktionskoefficient för ss, ger högre absorbans.
Värm upp prov med dubbelsträngat och plotta kurva med absorbans på y-axeln. Ta sedan Abs-max och dividera med 2 = Tm.

Question 38

Vilka ljusområden använder fluroescens?

Answer 38

Oftast UV- och synligt ljus (runt 175-700nm).

Question 39

Ge exempel på applikationer för fluorescens?

Answer 39

o Visualisering/detektion av DNA/protein.
o Protein:protein interaktioner.
o Förändringar i proteinstruktur.
o Cellassays (ex. flödescytometri, fluorescens-mikroskopi).
o Proteinlokalisering (även in vivo).

Question 40

Hur går mätningen till?

Answer 40

1. Excitation av en flurofor genom absorbans av foton.
2. Elektronen ockuperar tillståndet 1-10ns. Energi i form av värme avges.
3. Elektronen går till grundtillståndet, avger energi i form av fotoner.

Question 41

Hur kan elektronen avge energi?

Answer 41

o Kollision med molekyler i lösningen värme.
o Fluorescens.
o Resonance energy transfer.
o Andra fenomen.

Question 42

Vad är grundprincipen för fluorescens?

Answer 42

Excitation genom ljusabsorbans, relaxing till grundtillstånd, resulterar i ljusemission. Det emitterade ljusets våglängd blir längre jämfört med det absorberade då det har lägre energi.
I det exciterade tillståndet går fotonen alltid ned till grund-vibrationstillståndet.

Question 43

Hur påverkar våglängdsspektrumet som väljs för excitation?

Answer 43

Emissionsspektrumet ser identiskt ut (samma våglängder men färre antal molekyler som exciteras och färre fotoner ut, lägre profil om man väljer lägre våglängd) beroende på vilket excitationstillstånd som väljs. Intensiteten är beroende av våglängden som används för excitation.

Question 44

Vad beror fluorescensintensiteten av?

Answer 44

Samma parametrar som absorption (se parametrar i Lambert-Beers lag). 
Quantum yield (Q=F/A). Där F är antal emitterade fotoner och A är absorberade fotoner. OBS, Q är lika med eller större än 0 men mindre än eller lika med 1.

Question 45

Varför vill man ha hög quantum yield?

Answer 45

Detta p.g.a. att andra fenomen konkurrerar med fluorescensen. Ex. kollision med molekyler i lösningen som ger energi i form av värme, detta ges inte tillbaka som strålning.

Question 46

Hur skiljer sig en fluorescens-spektrometer från en vanlig?

Answer 46

Normalt mycket högre känslighet jämfört med absorbans tack vare olika våglängder av exciterande och emitterande ljus, detektionen sker inte i strålgången för exciterande ljus, generellt låg bakgrundsfluorescens. Många molekyler som SDS har bakgrundsabsorbans, men ofta inte fluorescens. Mäter i 90 graders vinkel så att vi får mindre strö-ljus från lampan.

Question 47

Fördelar/nackdelar med fluorescens-spektrometri?

Answer 47

Fördelar:
o Snabb metod.
o Hög känslighet & specificitet jämfört med absorbans.
o Brett koncentrationsområde (dynamic range) jämfört med absorbans.
Nackdelar:
o Dyrare instrument jämfört med absorbans.
o Kan påverkas kraftigt av bland annat pH (beroende på fluorofor).

Question 48

Vad är intrinsic fluorescens?

Answer 48

De flesta protein är fluorescenserande, men svagt. Ger låg quantum yield. Trp är dock mätbar, kan användas för konc. bestämning och struktur.

Question 49

Hur påverkar omgivningen intrinsic fluorescens?

Answer 49

Omgivning med högre polaritet ger generellt längre våglängd för emissionsmaximum –> rött skift.

Question 50

Vad är extrinsic fluorescens?

Answer 50

Fluorescens som kommer utifrån, konjugera med molekyler. Kovalent konjugering (inmärkning) av proteiner som antikroppar med fluorescenta molekyler. Kan vara genetiska fusioner som mCherry.

Question 51

Vad står FRET för?

Answer 51

fluorescence resonance energy transfer

Question 52

Vad är FRET?

Answer 52

Har en exciterad donor-kromofor som överför energi till en acceptor-kromofor via icke-strålningsbaserad energiöverföring. Proportionellt mot 1/R6 där R är avståndet mellan kromoforerna. Det är extremt känsligt för små avståndsförändringar. Effektivt avstånd är 1-10nm.

Question 53

Applikationer för FRET?

Answer 53

o Protein:protein interaktioner.

o Strukturförändringar

Question 54

Är alla kromoforer fluoroforer?

Answer 54

Alla fluroforer är kromoforer men alla kromoforer är inte fluoroforer.

Question 55

Sammanfatta spektroskopisa metoder. Användning?

Answer 55

Spektroskopiska metoder är baserade på interaktioner mellan materia och stålning. Väldigt vanliga för studier av biomolekyler.

Question 56

Sammanfatta Absorbans UV/Vis användning.

Answer 56

Absorbans UV/Vis används främst för koncentrationsbestämning av proteiner och DNA/RNA.

Question 57

Sammanfatta Fluorescens användning.

Answer 57

Fluorescens används främst för visualisering av biomolekyler.

Question 58

Sammanfatta FRET användning.

Answer 58

FRET används främst för studier av protein:protein interaktioner.

Question 59

Vad innebär det att absorbansmaximum skiftar?

Answer 59

Blått skift innebär att max flyttas mot kortare våglängder, dvs mot den blå delen i synliga spektrumet. Rött skift innebär att max flyttas mot längre våglängder, dvs mot den röda delen i synliga spektrumet. Det är därför viktigt att säkerställa att det förhållanden man tänkt mäta vid inte påverkar absorbansen.