FL 2

Question 1

Var kommer energin från i luminometri?

Answer 1

Från en kemisk eller enzymatisk reaktion.

Question 2

Hur skiljer sig luminometri från fluorescens?

Answer 2

I fluorescens kommer energin från en foton, inte från en kemisk/enzymatisk reaktion.

Question 3

Vilka fördelar/nackdelar finns det med luminometri?

Answer 3

Fördelar:
- Vanligtvis hög quantum yield.
- Inga bakgrundssignaler från exciterande ljus -> hög känslighet.
Nackdelar:
- Kräver flera olika molekylära komponenter (ex. enzym & substrat) mer komplext.

Question 4

Vilket är det vanligaste enzymet i bioluminsecens-reaktioner?

Answer 4

Luciferas som förekommer naturligt i eldflugor och får dem att lysa.

Question 5

Hur fungerar reaktionen med luciferas?

Answer 5

Luciferas är enzymet som katalyserar reaktionen. Luciferin tillsammans med ATP ger luciferyl adenylate och PPi. Vid närvaro av syre oxideras luciferyl adenlyate till oxyluciferin, AMP och ljus!

Question 6

Hur uppstår ljuset i reaktioner med luciferas?

Answer 6

Det uppstår som ett resultat av elektroner då de faller tillbaka till sitt grundtillstånd.

Question 7

Hur kan luciferas användas för att se om ATP genereras?

Answer 7

Om man har en cell som genererar ATP och innehåller luciferas så kan man tillsätta luciferin vilket leder till att man får en ljusblixt varje gång en reaktioner sker då ATP genererats.

Question 8

Hur kan luciferas appliceras på pyrosekvensering?

Answer 8

Man har sitt templat som man vill sekvenser och använder DNA-sequencing by synthesis. Tillsätter vardera nukleotid en i taget och ser om de binder in. O en binder in avspjälkas en pyrofosfat och ett tillsatt enzym omvandlat det till ATP vilket genererar en ljusblixt tack vare luciferin. Detekterar att nukleotiden bundit in.

Question 9

Vad använder man Alpha Screen till?

Answer 9

Till att detektera protein:protein interaktioner.

Question 10

Hur fungerar Alpha Screen?

Answer 10

Det baseras på luminescens. Har en donor bead (kräver ej luminescens) som kopplas till interaktionspartner och acceptor bead (kräver luminescens). Då donor bead exciteras vid 680nm produceras singlet O2. Om det finns accepter bead inom 200nm kommer singlet O2 att reagera med ämne i acceptor bead vilket leder till emission kring 520-620nm. Då kan signalen detekteras.

Question 11

Varför är Alpha Screen enklare att utföra än FRET?

Answer 11

Nackdel med FRET är att det är svårt att få accepter och donor bead att binda på det korta avståndet (10nm) och därmed är det enklare för alpha screen.

Question 12

Vad är cirkulär-polariserat ljus?

Answer 12

Den elektriska fältvektorn har konstant amplitud men riktningen förändras cirkulärt. Om man tittar i en punkt ser man att vektorn roterar åt höger eller vänster med tiden. Ljuset vrider sig kontinuerligt.

Question 13

Vad är CD-spektroskopi? Vad står det för?

Answer 13

Det innebär absorbans av cirkulär-polariserat ljus. Står för circular dichroism.

Question 14

Vad innebär dichroism?

Answer 14

Studerar skillnaden i absorbans mellan höger- och vänstervridet cirkulär-polariserat ljus.

Question 15

Hur fungerar CD?

Answer 15

Aminosyror är virala molekyler och absorberar höger- och vänster CD ljus olika. De asymmetriska peptidbindningarna är kromosomer och absorberar ljus i UV-området. Proteinets sekundärstruktur påverkar starkt absorbansen av cirkulärpolariserat ljus. Orientering av peptiderna påverkar alltså hur proteinerna absorberar ljuset.

Question 16

Vad är random coil?

Answer 16

Oveckat protein, ser ej om det är alfa helix eller beta flak…

Question 17

Vad är ellipticitet?

Answer 17

Skillnaden i absorbans mellan höger och vänstervridet cirkulär-polariserat ljus.

Question 18

Hur kan CD-spektroskopi användas för att verifiera sekundärstruktur?

Answer 18

Om vi har ett protein vi tidigare kollat så vet vi hur profilen ser ut. Om vi sedan muterar eller lägger till något vill vi sedan verifiera att sekundärstrukturen är samma. Mäter igen och jämför med gamla.

Question 19

Kan man se om tertiärstrukturen ändrats med CD?

Answer 19

Om sekundärstrukturen är exakt samma efter ex. mutering så ger det en stark indikation på att tertiärstrukturen ej förändrats nämnvärt.

Question 20

Vilka förändringar i struktur kan mätas med CD?

Answer 20

kemisk stabilitet, strukturförändringar vid interaktioner, värmestabilitet,

Question 21

Hur bestämmer man värmestabilitet med CD?

Answer 21

Ett denaturerat protein som förlorat sin sekundärstruktur kommer uppvisa ett random coil-spektrum. Beroende på om man har beta flak eller alfa helix får man ett visst spektrum. Man vill ha så stor skillnad som möjligt mellan random coil och de andra spektrumen. Lägger sig helst där det är stor skillnad men där är det mycket bakgrundsabsorbans, mäter vid 220nm. Värmer upp protein, plottar signalen vid 220nm mot temperatur och får då en kurva där maxabsorbansen div. med 2 ger smälttemperatur.

Question 22

Vilka fördelar och nackdelar finns det med smälttemperatur-bestämning med CD?

Answer 22

Fördelar:
- Snabb och enkel metod.
- Icke-destruktiv.
- Ger information om sekundärstrukturinnehåll utan att behöva lösa 3D-strukturen.
- Effektiv och enkel metod för analys av proteinstabilitet.
Nackdelar:
- Kräver relativt dyr instrumentering.
- Svårt att tolka resultat för stora proteiner som innehåller olika klasser av sekundärstrukturelement (dvs. ß-flak eller -helix…).

Question 23

Vad är infraröd spektroskopi (FT-IR)?

Answer 23

Absorbans i infraröda delen i spektrumet där våglängderna är längre än i det synliga ljuset. Påverkan blir förändring i rotations- och vibrationsstadier.

Question 24

Vad används FT-IR för?

Answer 24

Analys av små molekyler eller proteiner.

Question 25

Fördel med FT-IR?

Answer 25

Kan användas på fasta proteiner, behöver ej lösas. Bra om man har kristaller ex.

Question 26

Vad innebär Light Scattering?

Answer 26

Har proteiner i lösning och belyser med ljuskälla. Proteinerna sprider ljuset som då viker av i olika riktningar. Alltså INTE absorbans. Hur ljuset sprid beror av storlek på molekylerna.

Question 27

Vad är MALS?

Answer 27

Multi-angle light scattering. Innebär att man kan bestämma absoluta molekylvikten hos ex. protein. Mäter intensitet i olika vinklar, har ljuskälla och polarisering som belyser provet. Detektor mäter intensitet och med komplicerade beräkningar bestämmer man absolut molekylvikt.

Question 28

Fördelar/nackdelar med MALS?

Answer 28

Fördelar:
- Icke-destruktiv. Kan använda proteiner i nästa analys, förstörs ej.
- Analys i lösning.
- Detektion av små aggregat (t.o.m. monomerer särskiljs från dimer).
Nackdelar:
- Relativt dyrt.
- Inte lika brett dynamiskt område (kan ej mäta många små och stora protein/aggregat samtidigt) som DLS. Därför kombineras det ofta med gelfiltrering, SEC-MALS. Separerar först med gelfiltrering, tittar på fraktioner och analyser. Ser molekylvikt för vardera fraktionen. Se rening av biomolekyler.
- Generellt lägre känslighet, behöver högre proteinkoncentration.

Question 29

Vad är Dynamic Light scattering (DLS)?

Answer 29

Har ljuskälla, skickar ljus genom lins till provet. Foton-detektor mäter genom lins. Kollar på hur intensiteten förändras med tiden. Intensiteten påverkas av rörelsen hos biomolekylerna. Tittar på en liten punkt, när biomolekyler diffunderar in i punkten ökar intensiteten och då de diffunderar ut minskar den. Diffusionshastigheten fås ut och koefficienten bestäms. Genom detta bestäms den hydrodynamiska radien. Ex. används detta för analys av aggregering/löslighet.

Question 30

Fördelar/nackdelar med DLS?

Answer 30

Fördelar:
- Icke-destruktiv.
- Analys i lösning.
- Brett dynamiskt område av molekylvikter.
- Känslig, behöver ej lika hög proteinkoncentration.
Nackdelar:
- Relativt dyr och ovanlig (dvs, inte alla labb som har detta instrument).
- Ej absolut molekylvikt.
- Lägre upplösning jmf med MALS.

Question 31

Sammanfatta spektroskopi?

Answer 31

Interaktioner mellan materia och strålning. Vanliga för studier av biomolekyler.

Question 32

Sammanfatta användningg av Absorbans UV/Vis?

Answer 32

Främst för konc. bestämning av proteiner och DNA/RNA.

Question 33

Sammanfatta användning Fluorescens?

Answer 33

Främst för visualisering av biomolekyler.

Question 34

Sammanfatta användning FRET?

Answer 34

Främst för studier av protein:protein interaktioner.

Question 35

Sammanfatta användning CD?

Answer 35

huvudsakligen analys av sekundärstruktur och stabilitet.

Question 36

sammanfatta användning luminometri?

Answer 36

främst för att mäta ATP-genererande reaktioner.

Question 37

sammanfatta användning light scattering?

Answer 37

huvudsakligen för att bestämma molekylvikt, storlek/form, aggregationer & löslighet.

Question 38

Vad bör man tänka på vid försökplanering?

Answer 38

om försöket är hypotesdrivet eller upptäcktsdrivet, vilken metod man ska använda, experimentella förhållanden, kontroller, replikat, randomiseringar och blinda försök.

Question 39

vad är en hypotes?

Answer 39

Hypotes är en teori som oftast baseras på tidigare kunskap.

Question 40

Vad är en hypotesdriven analys? Ge exempel.

Answer 40

En hypotes-driven analys innebär att man experimentellt testar en hypotes. Ex. om man testar antagandet att cancerceller är mer känsliga för DNA-skadande läkemedel på grund av deras snabbare celldelning.

Question 41

Vad är en upptäcks-driven analys? Exempel?

Answer 41

En upptäcks-driven analys är ej baserad på tidigare antaganden eller teorier. Ex. om man ska genomsekvensera eller bestämma 3D-struktur hos ett protein.

Question 42

Vad är en positiv kontroll? Exempel.

Answer 42

Innebär att man visar om metoden fungerar som tänkt. Minskar falska negativa. Ex. om man mäter CD eller absorbans och inte får signal så behöver det inte betyda att man inte har protein. Det kanske är så att detektorn är trasig?

Question 43

Vad är en negativ kontroll? Exempel.

Answer 43

Innebär att man visar att ett positivt resultat inte är en artefakt. Minskar falska positiva. Vi kanske tror att något är ett positivt resultat men det kanske var något som gått sönder och gav en signal där det inte skulle ha kommit signal annars

Question 44

Vad används flest gånger, neg. eller pos. kontroller?

Answer 44

Negativa.

Question 45

Varför bör man tänka på experimentella förhållanden?

Answer 45

Förhållanden/parametrar påverkar ofta resultatet av olika analyser och man bör ha slutgiltig applikation i åtanke. Ska man använda något i sura förhållanden bör man mäta bindning vid lågt pH för att se hur bindningen påverkas. Man försöker matcha förhållanden som temperatur, pH, jonstyrka, buffert, etc under förhållanden i experimentet.

Question 46

Vad är replikat?

Answer 46

Replikat innebär att man upprepar experiment för att öka signifikansen.

Question 47

Vad visar replikat på?

Answer 47

Detta visar på noggrannhet hos metoden/analysen och visar på biologisk variation i provpopulation.

Question 48

Vad används statistik för?

Answer 48

Statistik används för att dra allmänna slutsatser från begränsad mängd data. Det presenteras som sannolikheter (probability, P-värden). Statistisk tillförlitlighet ökar med antal prov (N).

Question 49

Vad kan fel/variationer vara?

Answer 49

Fel/variationer kan vara tekniska, experimentella, variationer (ibland biologiska). Oftast presenteras detta som standardavvikelse (SD) eller standard error of mean (SEM).

Question 50

Vad är randomiseringar?

Answer 50

Randomiseringar utförs om vi har ex. olika replikat och olika provet från olika personer. Ex. placerar man alla prover olika på en platta.

Question 51

Vad är blinda experiment?

Answer 51

Blinda experiment innebär att information om provet inte är avslöjat vid analystillfället och vid eventuell tolkning av resultat. När man mäter sitt prov vet man inte om det är en kontrollgrupp, cancerceller, icke-cancerceller, negativ eller positiv kontroll.

Question 52

Vad är dubbelblinda experiment?

Answer 52

Varken patient eller läkare vet om man får läkemedel eller placebo ex.