FL 4

Question 1

Vad innebär precipitering av celler?

Answer 1

Att cellerna faller ut, bildar större aggregat.

Question 2

Varför är immunoprecipitering bra, vad kan det användas till?

Answer 2

Det är bra för att det medger visuell detektion. Kan användas för att bestämma blodtyp.

Question 3

Hur bestämmer man blodtyp med immunoprecipitering?

Answer 3

Man tar blod från blodgivaren och serum från mottagaren och blandar dessa. Om antikroppar i serumet från mottagaren reagerar och binder till de röda blodcellerna från donatorn så bildas det nätverk, cellerna klumpas ihop. Det är en match! Om vi inte har agglutinering (alltså fel blodtyp) ser man hela droppen.

Question 4

Vilka krav finns för att uppnå agglutinering?

Answer 4

• Bindarreagensen (anti-A) måste kunna binda minst två celler (alltså ha bivalens).
• Cellen måste också ha flera receptorer (multivalens).

Question 5

Vad kan kul-kopplande antikroppar användas till? Hur går det till?

Answer 5

Ex. graviditetstest. HCG-hormonet ökar i kroppen vid graviditet. Antikroppar är kopplade till kulor. Prov (urin) tillsätts och dras fram med kapillärkraft till linje där annan antikropp mot hormonet finns. Antikropparna binder olika epitop på hormonet. Sandwich-assay med två antikroppar och antigener mellan sig. Första linjen säger om man är gravid. Om kulorna bundit hormonet kan hormonet binda antikroppen och kulorna fastnar -> blått streck. sen finns kontrollinje där man har antikropp mot antikroppen. detekterar kulor så inget blivit fel, ska alltid bli blå.

Question 6

Varför är kul-baserad metoder främst riktade mot konsumenter?

Answer 6

För att detektionen sker visuellt, inte kräver något instrument.

Question 7

Vad står ELISA för?

Answer 7

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Question 8

Förklara sammanfattat vad ELISA är?

Answer 8

är ett samlingsbegrepp för flera principer. Metoden används för detektion av antigen främst. Det sker oftast i mikrotiter-plattor (ex. 96-brunnars) och baseras på enzym-konjugerade antikroppar. Substrat som enzym kan omvandla till produkt som ger färg och signal mäts spektrofotometriskt. Det kan kombineras med standardkurva för kvantifiering.

Question 9

Vad är direkt ELISA?

Answer 9

Direkt ELISA är enklast. Man har en fast fas där man kan koppla antikroppar. Kan vara ex. i brunn eller kul-baserat. Enzym-konjugerad antikropp tillsätts, provet tvättas, substrat tillsätts, produkt mäts. Denna metod används dock inte jättemycket då det är svårt att mäta antigenet om det är kopplat till ytan.

Question 10

Vad är indirekt ELISA?

Answer 10

Man har antikropp som prov. Man har även en sekundär antikropp med enzym. Tillsätter substrat och får färg.

Question 11

Vad är sandwich ELISA?

Answer 11

Har en capture-antikropp i botten, tillsätter antigen och en antikropp som binder. Sedan tillsätts en annan antikropp med enzym. De får ej binda till samma epitop då man vill att de ska binda samtidigt.

Question 12

Vad är kompetitiv ELISA?

Answer 12

Har ett antigen, tillsätter antikropp och substrat. Blir en tävling mellan bindning till ytan med antigen och till provets antigen. Ju högre konc. du har av antigenet i ditt prov, ju lägre signal kommer du att få. Bra för att detektera låga koncentrationer.

Question 13

Vad kan indirekt ELISA användas till?

Answer 13

Indirekt ELISA används till att detektera hur bra (starkt) antikroppen binder antigenet och om den ens binder. I ett okänt prov kan vi detektera antikroppar för ex. sjukdomstest. Många sjukdomar som HIV har lite antigen i serumet, viruset gömmer sig i celler. Vid virusinfektion får vi ett immunsvar i form av antikroppar. Man kan alltså påvisa infektion genom detektion av antikroppar mot virusets protein.

Question 14

Vad kan sandwich ELISA användas till?

Answer 14

Sandwich ELISA kan användas till att detektera om antikroppar binder till olika epitoper. Används främst för att detektera antigen. Vill bestämma okänd koncentration eller se om vi har antigen i provet. Sätter upp sandwich ELISA. Har capture, tillsätter okända. Tillsätter antikropp 2 och substrat.

Question 15

Vad är skillnaden för icke-enzymbaserade ELISAs (förutom icke-enzym)?

Answer 15

Kräver generellt mer komplicerad och dyrare utrustning. Man kan använda fluorofor eller radioaktiv molekyl ex. istället för enzym

Question 16

Vilka tre steg utförs i Westen-blot?

Answer 16

1. Gelelektroforetisk storleks-separation (ofta SDS-PAGE).
2. Överföring av separerat prov till nitrocellulosa/PVDF-membran.
3. Specifik detektion med inmärkta antikroppar.

Question 17

Används western-blot för kvantitativ eller kvalitativ analys?

Answer 17

Kvalitativ, ex. för att se om vi har protein i provet.

Question 18

Vilken fördel finns med western-blot jämfört med ELISA?

Answer 18

En fördel med western-blot jämfört med ELISA är att man undviker falsk detektion av något som är för stort/litet. I ELISA får vi endast signal, kan finnas artefakter som falska positiva. I western-blot får vi även storleksinformation så vi ser om den har samma storlek som vår antigen och får då starkare indikation på att vi detekterat rätt

Question 19

Hur utförs western-blot?

Answer 19

Proteinet är först nativt sedan introduceras negativa laddning med SDS som också denaturerar. B-mercaptoethanol reducerar disulfider. Gelen körs och proteiner separeras efter storlek. För över membran till gelen och använd antingen elektrofores eller kapillärkraft för att få proteinet att vandra från gelen till membranet. Man blockerar också membranet så att inget binder ospecifikt. Antikroppar tillsätts (antingen sekundärt eller primärt inmärkta för detektion).

Question 20

Vad är viktigt att tänka på under western-blot?

Answer 20

Epitoper för antikroppar kan förstöras av SDS-behandling. Det är viktigt att tänka på att mAb binder till en strukturell epitop och alltså ej kommer fungera i Western blot om man kör SDS-PAGE innan.

Question 21

Vad är antikropps-/protein-arrayer?

Answer 21

liknar ELISA. Det är i princip en fluorescensbaserad, multi-plex ELISA. Man kan analyser tusentals prover parallellt. Det har samma format som ELISA, kan vara direkt, indirekt, sandwich eller kompetitivt. Vanligtvis fluorofor-baserade men även enzym eller kulor. Det är inte lika kvantitativt som ELISA, man får ofta ett ja/nej-svar.

Question 22

Vad används antikropps-/protein-arrayer till?

Answer 22

Det används främst för proteomik-studier och ger detektion av multipla analyter parallellt.

Question 23

Vad används immunohistokemi (IHC) till?

Answer 23

Immunohistokemi (IHC) används för lokalisering av proteiner i vävnadssnitt.

Question 24

Vilka frågor svarar immunohistokemi på?

Answer 24

o I vilken vävnad finns proteinet?
o I vilken celltyp finns proteinet?
o Var i cellen finns proteinet?

Question 25

Varför är det viktigt att lokalisera proteiner i vävnadssnitt?

Answer 25

Det är viktigt för ledtrådar till funktionen hos outforskade proteiner samt för att hitta nya målproteiner för läkemedel/diagnostik. Man kan ex. jämföra proteiner hos lungcancerceller och frisk vävnad. Om det endast finns vissa proteiner hos lungcancer så kan det användas till att ta fram botemedel så att endast den sjuka vävnaden ”attackeras”.

Question 26

Hur utförs immunohistokemi?

Answer 26

Man har en vävnad och tillsätter en primär antikropp. Provet tvättas och en sekundär antikropp som är enzym-konjugerad tillsätts. Sedan tillsätts substratet. Vi får en färgad produkt som kan visualiseras när man kollar på mikroskopibilder. Många gånger måste en patolog eller biolog titta på snitt för att se vilken del av vävnaden som har vilka celler, man får då information om vad proteinet har för funktion.

Question 27

Vilket format på immunohistokemi är vanligast?

Answer 27

Man kör ofta immunohistokemi i array-format med s.k. vävnadsmatriser som tissue micro assays (TMAs). Vävnaden är fryst i stavar och överförs till block. De skivas extremt tunt för att få cirkelformade vävnadssnitt och sedan tittar man på detta i mikroskopiglas.

Question 28

Vad är Immunofluorescens-mikroskopi?

Answer 28

Man tittar på celler och har fluorescensinmärkta antikroppar för att kunna se om proteinet finns. Man har en hög upplösning och kan titta på subcellulära fraktioner, dvs vilka organeller proteinet finns i. Då får man ledtrådar om dess funktion. Man kan se uttrycksnivåer och lokalisation av proteinet. Här används ofta fluoroforinmärkta antikroppar vilket vanligtvis ger subcellulär information. Kräver permeabilisering då antikropp ej kan komma genom membran, man måste luckra upp lite men kom ihåg att vara försiktigt så man inte genom permeabiliseringen förändrar proteinet intracellulärt.

Question 29

Vad används flödescytometri för?

Answer 29

Flödescytometri är en metod för att räkna, analysera och sortera (vissa instrument) partiklar som celler eller kulor i ett flöde.

Question 30

Vilka sorters flödescytometri finns?

Answer 30

o Singelcell-analys. Tittar på vardera enskilda cell åt gången.
o Multiparameter-analys. Tittar på flera parametrar samtidigt. Tittar på många celler samtidigt.

Question 31

Vilka tre delar består flödescytometri av?

Answer 31

• Optik.
• Fluidik.
• Elektronik.

Question 32

Hur går flödescytometri till?

Answer 32

Man har inmärkta celler och principen liknar ELISA. Antikropparna är fluorescerande och kommer ut genom nozzle efter flöde. Hastigheterna är 10k–100k celler/s och man kan få väldigt mycket information på kort tid. Genom flödet passerar en cell åt gången, går ner i flödet, passerar laser som belyser vätskan. Lasern belyser partikeln och man samlar info om fluorescensparametrar och analyserar.

Question 33

Hur skiljer sig flödescytometri från cell-ELISA?

Answer 33

Principen är som cell-ELISA men i hög throughput vilket gör att man kan analysera många celler på kort tid. Om vi kör på 10k celler/s så kan vi på 100s analysera en miljon celler. Mäter vi i kyvett får vi olika värden på fluorescens och ett medelvärde för de en miljon cellerna i provet. Man ser ingen variabilitet mellan cellerna. Med flödescytometri får man variabiliteten då vi ser fluorescens för varje cell.

Question 34

Hur mäts fluorescensen i flödescytometri?

Answer 34

Fluorescens mäts ofta med fluoroforinmärkta antikroppar vilket är en kvantitativ metod då man kan mäta proteiner på cellytan. Det kan även vara intracellulär fluorescens som GFP.

Question 35

Vad är ett histogram? Hur ser de ut för absorbans/flödescytometri?

Answer 35

Resultat ses i form av data – histogram. Vid en kyvettbaserad metod får vi ett medelvärde men här får vi fluorescensintensitet på x-axeln, antal celler på y-axeln och ser fördelningen av de tre olika proverna. I varje prov har vi en del celler med medelfluorescensen och vissa med väldigt låg respektive hög fluorescens. X-axeln är logaritmerad så skillnaden är väldigt hög, vi har stor variabilitet.

Question 36

Hur vet vi om signalen är hög eller låg för flödescytometri?

Answer 36

Vi sätter upp en kalibrerkurva av kontroller som man relaterar signalen till. Kör friska celler som saknar receptorer med samma inställningar som cancercellerna. Vi ser då skillnad mellan kontroll och prov. Har vi 10 gånger högre signal så har vi 10 gånger mer receptorer på cancercellen jämfört med friska cellen. Slöseri med tid att bara köra ett prov utan kontroller.

Question 37

Hur kan signalen för flödecytometri visas på graf?

Answer 37

Data kan skrivas i form av dot-plot. Då kan vi se om vi har någon korrelation. Vi plottar receptor A och B och ser om vi har mycket av någon av dem. A hamnar på x-axeln och B på Y-axeln.

Question 38

Fluorescense-activated cell sorting (FACS) används till?

Answer 38

Cellsortering. Ex. om vi endast vill ha ut T-celler från vårt blod. Då tar vi antikropp som specifikt känner igen T-celler. Kör i flödescytometer och plockar ut endast T-celler i hög throughput.
Preparativ metod! Liknar flödescytometri.

Question 39

Hur skiljer sig FACS mot flödescytometri (principen)?

Answer 39

skillnaden är att vi analyserar signal och om signalen då är över ett visst tröskelvärde så fortsätter analyten ned och hela nozzle vibrerar. En bit ned kommer strömmen brytas upp i droppar. De innesluter cellerna, vet hur lång tid det tar för en viss cell att komma ned och hela strömmen laddas. När den bryts av behåller den sin laddning och åker sedan genom ett elektriskt fält. Hamnar i olika bägare pga laddning. Separerar celler i droppar beroende på fluorescens och scattering.

Question 40

Vad kan flödescytometri tillämpas på?

Answer 40

o Fenotypning av celler innebär att olika celler kan ”typas” och kvantifieras baserat på ”profilen” av olika ytreceptorer, ex. analys av blodceller.
o Mikrobiologi i form av detektion, fenotypning och kvantifiering av mikroorganismer.
o Validering av antikroppar för att verifiera att antikroppen kan binda till antigenet när det är presenterat på cellytan.
o Cellcykel-analys för att mäta DNA-innehåll.
o Cell-viabilitet för inmärkning av levande/döda celler.

Question 41

Hur väljer man antikroppsreagens?

Answer 41

o Olika metoder presenterar antigenet i olika former.
o Metoden kan ha särskilda krav som ex. bivalens vid IP.
o Antikroppar som fungerar väl i en metod behöver inte vara lämpliga för en annan.
o Man bör överväga aviditet/valens, specifitet, affinitet, epitoper, polyklonal/monoklonal och tillgängliga sekundärreagens.