flashcards_dna

Question 1

Jakie są etapy izolacji DNA metodą ekstrakcji fenolowej?

Answer 1

1.Usunięcie ściany komórkowej:mechaniczne niszczenie poprzez rozcieranie w ciekłym azocie - homogenizacja
rozkład enzymatyczny – celulazy, pektynaza

2. Liza komórek: Rozpuszczenie błon komórkowych za pomocą detergentów, takich jak SDS lub CTAB, Mieszaniny lizujące . 3. Usuwanie białek: Stosowanie proteinaz, np. proteinazy K. 4. Ekstrakcja DNA: Z użyciem fenolu, chloroformu lub mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (24:1). 5. Precypitacja DNA: Wytrącanie DNA za pomocą etanolu (96%) lub izopropanolu ,Li Cl2 - chlorek litu, tRNA (niskocząsteczkowy DNA lub niskie stężenie w roztworze)
   . 6. Odpłukiwanie zanieczyszczeń: Przemywanie DNA 70% etanolem. 7. Suszenie: Odsuszenie próbki w eksykatorze. 8. Rozpuszczenie DNA: W buforze TE, NaOH (8 mM) lub jałowej wodzie. 9. Pomiar stężenia DNA: Np. spektrofotometrycznie.

Question 2

Dlaczego w metodzie ekstrakcji fenolowej stosuje się fenol i chloroform?

Answer 2

Fenol: Denaturuje białka, które tworzą odrębną warstwę podczas wirowania. Chloroform: Zwiększa skuteczność rozdzielania warstw wodnej (zawierającej DNA) i organicznej (zanieczyszczenia). Mieszanina chloroform:alkohol izoamylowy (24:1): Stabilizuje warstwy i zapobiega pienieniu.

Question 3

Jakie są metody dodatkowego doczyszczania DNA?

Answer 3

1. Dializa: Usuwa związki drobnocząsteczkowe, takie jak sole czy nukleotydy, przez błonę półprzepuszczalną. 2. Rozdział w żelu LMP (low melting point): Stosowany przy zanieczyszczeniach nierozpuszczalnych w wodzie;

Question 4

Na czym polega precypitacja DNA i jakie odczynniki są stosowane?

Answer 4

Precypitacja to wytrącanie DNA z roztworu przy użyciu: Etanolu 96% (-20°C), Izopropanolu, LiCl₂: Przy niskim stężeniu stężeniu/niskocząsteczkowym DNA

Question 5

Jak działa dializa jako metoda oczyszczania DNA?

Answer 5

Cząsteczki drobnocząsteczkowe (np. sole) przechodzą przez półprzepuszczalną membranę, pozostawiając w woreczku cząsteczki DNA. Proces przyspiesza sie mieszajac oraz wymiana roztworu zewnętrznego.

Question 6

Kiedy stosuje się rozdział w żelu LMP?

Answer 6

Przy zanieczyszczeniach wielkocząsteczkowych, takich jak gumy, żywice, alkaloidy. DNA jest wycinane z żelu i może być użyte do dalszych badań.

Question 7

Jak działa mechanizm separacji perełek magnetycznych?

Answer 7

Perełki zawierają tlenki żelaza wewnątrz, co umożliwia ich przyciąganie przez magnes. Ligandy na ich powierzchni wiążą DNA, które pozostaje przy perełkach podczas separacji.

Question 8

Czym jest elucja w procesie izolacji za pomocą perełek magnetycznych?

Answer 8

Elucja to proces wymywania DNA z powierzchni perełek magnetycznych za pomocą odpowiednich roztworów, np. niskosolnych.

Question 9

Jakie są etapy izolacji DNA za pomocą perełek magnetycznych?

Answer 9

1 Dodanie perełek magnetycznych do próbki (zawierającej DNA i bufor lizujący).
2 Wiązanie DNA z ligandami na powierzchni perełek podczas inkubacji z delikatnym mieszaniem.
3 Oddzielenie perełek z DNA od roztworu za pomocą magnesu.
4 Przemycie perełek buforem w celu usunięcia zanieczyszczeń.
5 Opcjonalnie: elucja DNA z perełek, jeśli dalsze badania tego wymagają.

Question 10

Jakie są zalety izolacji DNA za pomocą perełek magnetycznych?

Answer 10

1. Brak potrzeby wirowania i sączenia.
2. Wysoka wydajność i czystość izolacji.
3. Możliwość pracy z małymi objętościami próbek.

Question 11

1. Etap Izolacji DNA U

Answer 11

1.Usunięcie ściany komórkowej:mechaniczne niszczenie poprzez rozcieranie w ciekłym azocie - homogenizacja
rozkład enzymatyczny – celulazy, pektynaza

Question 12

2. Etap Izolacji DNA L

Answer 12

liza komórek - rozpuszczenie błon komórkowych z wykorzystaniem detergentów:
►SDS (sodium dodecyl sulfate)

►CTAB ( cetyl trimethyloammonium bromide
►Mieszaniny lizujące (izolacja z krwi, zawiesin tkanek zwierząt).

Question 13

3. Etap Izolacji DNA U

Answer 13

Trzeci etap to usuwanie białek:
(proteinazy np. proteinaza K)

Question 14

4. Etap Izolacji DNA O

Answer 14

oczyszczanie próbek DNA

►fenol – ekstrakcja fenolowa

►chloroform , chloroform : alkohol izoamylowy (24:1)

Question 15

5. Etap Izolacji DNA P

Answer 15

precypitacja , wytrącanie DNA z roztworu

► 96 % etanol ( -20 º C)

►izopropanol

Question 16

6. Etap Izolacji DNA O

Answer 16

Odpłukiwanie resztek buforu reakcyjnego i substancji użytych do precypitacji

► 70 % etanol

Question 17

7. Etap Izolacji DNA S

Answer 17

Suszenie DNA (np. w eksykatorze

Question 18

8. Etap Izolacji DNA R

Answer 18

Rozpuszczenie w buforze (Tris , EDTA), NaOH(8 mM) lub jałowa woda

Question 19

9. Etap Izolacji DNA P

Answer 19

Pomiar stężenia DNA (np.
spektrofotometrycznie)