Fundamentos de PCR cuantitativa en tiempo real

Question 1

¿Quién la diseñó?

Answer 1

Kary Mullis

Question 2

¿En qué consiste?

Answer 2

Técnica de replicación in vitro de una molécula de ADNg.

Question 3

¿Qué demilita la longitud del fragmento a replicar?

Answer 3

Primers
Cebadores → Oligos

Question 4

ADNg

Answer 4

ADN genómico normal

Question 5

PCR convencional

Answer 5

• Amplificación de una región genética específica.
• Gel de agarosa o acrilamida

Question 6

PCR cualitativo

Answer 6

• Identiificar presencia o ausencia de un fragmento específico.
• Dx de enfermedades infecciosas.

Question 7

PCR semicuantitativo

Answer 7

• Nivel de expresión de un gen (ARNm) → biopsias

Question 8

PCR cuantitativo

Answer 8

• Cantidad de microorganismos en ARNm de un gen en particular.

Question 9

PCR múltiple

Answer 9

• Amplificación de varias regiones génicas en una misma reacción de PCR.
• Cada región cuenta con sus pares de oligos.

Question 10

Principios básicos de la PCR

Answer 10

• Complementariedad
• Dirección 5´→3´libre

Question 11

Etapas

Answer 11

• Desnaturalización
• Replicación
• Elongación

Question 12

PCR vs Sanger

Answer 12

En Sanger el extremo 3´esta bloquedo por ddntps

Question 13

Componentes necesarios para una PCR

Answer 13

• ADN molde
• Primers u oligos
• DNApol
• dNTPs
• Mg (cofactor)

Question 14

Aparato usado para provocar la reacción en cadena de la polimerasa

Answer 14

Termociclador

Question 15

Forma en la qué se encuentran los dNTPs

Answer 15

• Trifosfatada → Estabilidad para formar enlace fosfodiester (N-N)

Question 16

Concentración de dNTPs necesaria para sintetizar ADN

Answer 16

50-200mM para 6.5-25mg

Question 17

Pasos para realizar una PCR

Answer 17

• Inicio de la desnaturalización → 95º por 5min.
• 35 ciclos de amplificación → Tem desnaturalización (95º, 30s) y tem alineamiento (50-50ºC, 30-40s), tem extensión (72ºC)
• Amplificación final → 72ºC, llenado de espacios (3mins)
• Almacenamiento temporal (4ºC)

Question 18

¿Cuántas copias aprox. se obtiene de una sola hebra de DNA en una PCR?

Answer 18

3millones de copias así pasada de chile

Question 19

Número de copias por ciclo

Answer 19

8

Question 20

Proceso de la PCR tiempo final

Answer 20

• Prepara gel agarosa o acrilamida
• Agregar gel a la cámara y buffer de corrimiento
• Preperar muestras y marcador de PM
• Corrimiento (- → +)
• Comprar bandas de muestras vs PM

Question 21

¿Quién descubrio la PCR en tiempo real?

Answer 21

Higuchi → modificación de tiempo final

Question 22

Ventaja de PCR tiempo real

Answer 22

• Se observa eel crecimiento de la curva de amplificación.
• Cualitativa o cuantitativa.

Question 23

Pasos de la PCR tiempo real

Answer 23

• Amplificación → Desnaturalización, alineamiento y extensión.
• Detección → Florescencia SYBER green o TaqMan.

Question 24

SYBER GREEN

Answer 24

• Intercalante → Se insertan al medio de la doble cadena.
• Más usado bromuro de etidio.
• Láser → Fluorece
• Entre más ciclos más flourescencia → curva exponencial.

Question 25

**TaqMan**

Answer 25

* Identificación de SNPs * Sonda con floroforo y apagador → región específica. * Polimerasa se une a primer * Sonda se complementa al replicar → separación flouroforo y apagador → Luz.

Question 26

**Mecanismo que permite genotipificar**

Answer 26

TaqMan

Question 27

**Flourófos de las sondas**

Answer 27

* VIC y FAM → reporteros

Question 28

**¿Qué absorbe la luz de los reporteros?**

Answer 28

Apagador

Question 29

**¿Qué permite el análisis de la PCR en tiempo real?**

Answer 29

Identificar la flourescencia conforme avanza la reacción.

Question 30

**Ventajas de la PCR en tiempo real**

Answer 30

* Cálcula eficiencia de la reacción. * No es necesario correr geles de agarosa para complementar. * Más rápida y eficaz que punto final

Question 31

**Aplicación de la PCR en tiempo real**

Answer 31

* Análisis de expresión → Cáncer * Investigación → Detección de polimorfismos asociados a enfermedades (E. caso-control) * Dx → SARS-COV2