Genética- Protocolos Perguntas

Question 1

Quais os reagentes necessários para PCR?

Answer 1

o H2O
o Tampão de PCR
o MgCl2
o Primer direto
o Primer reverso
o dNTPs
o Taq polimerases

Question 2

Porque é importante lavar com etanol a 30% e não a 100%?

Answer 2

o Os 30% de água deste etanol são importantes para lavar o excesso de sais.
o Com o de 100% etanol não conseguimos fazer tão bem.

Question 3

A concentração de DNA pode ser determinada através de que técnicas?

Answer 3

o Medição da absorvância por espetrofotometria
o Eletroforese em gel de agarose

Question 4

Porque adicionamos Glicerol à amostra na eletroforese?

Answer 4

• Para dar peso à amostra.

Question 5

Como é que a quantidade de agarose afeta a malha da eletroforese?

Answer 5

• Quanto maior a quantidade de agarose utilizada, menores vão ser os buracos da malha que forma.

Question 6

O que veríamos na eletroforese se o DNAgenómico tivesse sido degradado?

Answer 6

• Se o DNA genómico estiver degradado (em pequenos fragmentos) iriamos ver uma banda constante.

Question 7

O que são células competentes?

Answer 7

• São células bacterianas alteradas em laboratório, que têm uma parede celular que permite a passagem de DNA exterior para o interior.
• Um método usado para tornar as células competentes é o método químico que usa cloreto de cálcio quando se encontram na fase exponencial.

Question 8

O que é que os plasmídeos vetores contém?

Answer 8

• Polylinker formado por sequências reconhecidas por diferentes enzimas de restrição.
• Gene de resistência a um antibiótico(por exemplo, a ampicilina).

Question 9

O que vai determinar se a célula bacteriana vai ser resistente à ampicilina?

Answer 9

• Se permitiu a entrada do vetor ou não. Se não tiver permitido, não tem resistência e morrerá.

Question 10

Qual a sequência genética responsável pela produção de β–galactosidase?

Answer 10

• sequência lacZ!

Question 11

No final da realização da clonagem do DNA que células vamos obter? Nota: existem 3 hipóteses.

Answer 11

1. Células competentes resistentes à ampicilina mas não produzem β–galactosidase. (DNA dador interferir no gene lacZ);
2. Células competentes resistentes à ampicilina produtoras de β–galactosidase (não houve DNAdador);
3. Células competentes que morrem (não terem sido transformadas).

Question 12

Completa a seguinte frase:

As células transformadas produtoras de β–galactosidase vão tornar-se …..

Answer 12

• Azuis! Pois não houve ligação entre o vetor e o DNAdador o que fez com que houvesse conversão do seu substrato X-Gal num precipitado de cor azul.

Question 13

Quais são as células que nos interessam para o experimento e de que cor elas ficarão?

Answer 13

• Células competentes resistentes à ampicilina mas não produzem β–galactosidase.
• Ficarão de cor Branca!

Question 14

O que são cadeias palindrómicas ou palindromas?

Answer 14

• Uma sequência de DNA é um palíndroma quando a sua leitura na direção 5’ para 3’ é idêntica à sua leitura na direção 3’ para 5’, quando esta última é invertida. Em outras palavras, é uma sequência que é idêntica quando lida de trás para frente.

Question 15

As enzimas de restrição produzem …..

Answer 15

• Cadeias palindrómicas.

Question 16

Qual a diferença entre Neosquizómeros e Isosquizómeros?

Answer 16

• Neosquizómeros – diferentes enzimas de restrição que reconhecem a mesma sequência, mas cortam-na de diferentes maneiras.
• Isosquizómeros – enzimas de restrição que reconhecem a mesma sequência e cortam do mesmo modo.

Question 17

As endonucleases de restrição estão divididas em que tipos? Distingue-os!

Answer 17

• Estão divididas em 3 tipos: Tipo I; II; III.
• Tipo I⭢ o local de reconhecimento e restrição diferem e estão longe.
• Tipo II ⭢ o local de reconhecimento e restrição são os mesmos.
• Tipo III ⭢ reconhecem 2 sequências não palindrómicas separadas e inversamente orientadas.

Question 18

Complete a seguinte frase:

A neutralização da carga das bactérias é feita com ………

Answer 18

• cloreto de cálcio.

Question 19

Qual o objetivo do choque térmico depois da adição dos vetores?

Answer 19

• O choque térmico serve para o DNA entrar nas bactérias;
• SOC serve para as bactérias recuperarem do choque térmico.

Question 20

Em que consiste o Método de Sanger?

Answer 20

• Adiciona-se inibidores da replicação do DNA: ddNTPs (didesoxiribonucleótidos trifosfatados).
• Estes ddNTPs não possuem o grupo 3’-OH pelo que não conseguem ligar-se a outros nucleótidos, impedindo assim o processo de replicação.

Question 21

Quais as vantagens do Método de Sanger?

Answer 21

• Simples;
• Flexível no que diz respeito ao local da marcação (primer, dNTP ou ddNTP) e o tipo de marcador utilizado (radioativo ou ligado a um flurocromo).

Question 22

Em que consiste o Método de Maxam-Gilbert?

Question 23

Quais as desvantagens do Método de Maxam-Gilbert?

Answer 23

• Demorado;
• Dispendioso;
• Utilizava reagentes tóxicos;
• DNA a ser sequencializado tinha de ser obrigatoriamente purificado.

Question 24

A que concentração está uma amostra pura de DNA com valor de A260 de 1?

Answer 24

• 50 μg/ml!

Question 25

Qual o propósito de um sistema tamponado na eletroforese?

Answer 25

• O sistema tampão de eletroforese (TAE) é essencial para a passagem da corrente elétrica: dá eletrólitos à solução e ajuda a manter o pH da solução.

Question 26

A DNApolimerase lê a cadeia molde em que direção?

Answer 26

• Lê de 3’-5’!
• Sintetiza de 5’-3’!

Question 27

Qual a diferença entre a Pfu e a Taq?

Answer 27

• Ambas provêm de organismos diferentes.
• Pfu ⭢ maior fidelidade por possuir uma atividade exonucleolítica 3’ -> 5’, oq confere um emparelhamento correto das bases complementares.
• Taq ⭢ menos suscetível a degradação da
  sequência amplificada.

Question 28

O que são células competentes?

Answer 28

• Células modificadas artificialmente para que o DNA exterior consiga entrar dentro das mesmas. Isto acontece devido a alterações na parede celular.

Question 29

Como funciona o cloreto de cálcio para tornar as células quimicamente competentes?

Answer 29

• O cloreto de cálcio vai neutralizar a carga da membrana das bactérias, oq contribui para a
  entrada de DNA dentro das células bacterianas.

Question 30

Indique duas características comuns a todos os tipos de vetores de clonagem.

Answer 30

• Conseguem incorporar DNA estranho e levá-lo para dentro de uma bactéria, onde vai ser reproduzido de forma autónoma, dentro das células, contêm um marcador genético que permite a seleção (normalmente resistência ao antibiótico), contêm locais de restrição que facilitam a clonagem do fragmento a inserir e contêm uma quantidade mínima de DNA não essencial, oq otimiza a clonagem.

Question 31

Qual a aplicação prática do “polylinker” dum plasmídeo vetor?

Answer 31

• Contém múltiplos sítios de restrição para enzimas de restrição. Cada sítio de restrição é uma sequência específica de nucleotídeos reconhecida por uma enzima de restrição particular.

Question 32

“É possível obter uma ligação dum fragmento de DNA a um vetor de clonagem usando somente extremidades coesivas (sticky-ends).” A afirmação é verdadeira ou falsa? Justifique.

Answer 32

• Não, para estas extremidades se formarem é necessário haver a formação de ligações covalentes. Estas são feitas por DNA ligases.

Question 33

O que entende por “ligação T-A” e em que condições pode fazer uma reação deste tipo?

Answer 33

• É uma ligação direta do DNA dador ao vetor, através da extremidade 5’ do DNA. Esta é rica em A, havendo assim ligação aos T’s do vetor, que se encontram também na extremidade. Isto pode ocorrer após o PCR.