H8 Detectiemethoden Flashcards
(33 cards)
ATP-meting (Telmethoden: op metabole activiteit gebaseerd)
Met een ATP meting wordt de hoeveelheid ATP (energie) gemeten. Aanwezigheid van ATP wijst op de aanwezigheid van MO.
Voordeel: eenvoudig, snel
Nadeel: Veel beperkingen, grensreacties (bv gisten produceren veel ATP)
Flowcytometrie (Telmethoden: op miscroscopische technieken gebaseerd)
(min 10³/ml) cellen in een vloeistofstroom passeren een detector.
Detecteert: fysieke & biochemische eigenschappen
Onderscheid levende vs dode cellen mogelijk
Toepassing: fermentatieprocessen.
qPCR: een grafiek herkennen (Telmethoden)
Kwantitatieve PCR: de hoeveelheid van een target-DNA is te meten
ELISA (op immunochemische technieken gebaseerd)
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
Enzymreactie om de binding tussen antigeen & antilichaam zichtbaar te maken
alle immunochemische bepalingen zijn gebaseerd op hetzelfde principe, de specifieke binding tussen antigeen en antistof. Door het aantonen daarvan in het bloed, serum of andere lichaamsvloeistof van een mens of een dier is het mogelijk bij te dragen aan de diagnose van een infectieziekte of een auto-immuunziekte.
De ELISA wordt uitgevoerd via een vast aantal stappen. Eerst worden de antigenen van het te testen monster gehecht aan een oppervlak, meestal in een microtiterplaat. Vervolgens wordt een antilichaam toegevoegd, dat zich specifiek bindt aan het antigeen van interesse. Dit antilichaam wordt gekoppeld aan een enzym. Nadat alle ongebonden antilichamen zijn verwijderd, wordt een substraat toegevoegd. Als er sprake is van binding, produceert de enzymatische reactie een detecteerbaar signaal, meestal een kleurverandering.
Conventionele PCR (op DNA/RNA gebasseerd)
Werkwijze
Werkwijze:
-ophoping (beschadigde MO herstellen)
-DNA-extractie
-PCR-reactie
Sandwich assay (ELISA)
??
Het antigeen wordt vastgehouden tussen de antistof en een label gekoppeld aan de antistof.
Het sandwich ELISA-formaat wordt veel gebruikt vanwege de gevoeligheid en specificiteit.
Er kan ook gebruikgemaakt worden van twee verschillende antilichamen (secundaire detectie):
Sandwich ELISA: Een ongemerkt antilichaam wordt voor de stof die gemeten wil worden gepipetteerd in de welletjes.
Competitieve assay (ELISA)
??
Een competitieve bindingstest meet doorgaans de binding van een gelabelde ligand aan een doelwitproteïne in aanwezigheid van een tweede, concurrerende maar ongelabelde ligand . Deze test kan worden gebruikt om kwalitatieve bindingsinformatie te beoordelen, evenals relatieve affiniteiten van twee of meer moleculen voor één doelwit.
Immunoconcentratie (op immunochemische technieken gebaseerd)
??
Antistoffen worden gebruikt als hulpmiddel voor het concentreren van organismen zodat een tweede kweekstap niet meer nodig is.
Immunomagnetische separatie.
LIA (op immunochemische technieken gebaseerd)
??
Lateral flow immunoassay
Principe van dunnelaag-chromatografie
Real-time PCR (op DNA/RNA gebasseerd)
Tijdens de PCR reactie is het signaal met fluorescerende probes te volgen.
De sterkte van het signaal is evenredig met het product
Hoe meer gezochte bacteriën aanwezig, hoe sneller de Ct-waarde wordt bereikt
PFGE (Identificatie- en bevestigingstechnieken)
Pulsed-field gel electrophoresis
Een bacteriecultuur wordt in een elektrisch veld geplaatst waar het DNA gescheiden wordt op basis van grootte. Op basis hiervan kan een foto gemaakt worden en geïdentificeerd worden.
WGS (Identificatie- en bevestigingstechnieken)
Whole Genome sequencing
Bepaalt de volgorde van de basen. Dit leidt tot een zeer exacte DNA-vingerprint.
Voordeel: Een uitbraak kan snel gedecteerd worden.
Telmethoden
1: Compacte alternatieven voor de telplaat
2: Chromogene & fluorogene agars
3: Op MPN gebaseerd
4: Op metabole activiteit van MO gebaseerd
5: Op microscopische technieken gebaseerd
6: qPCR
Detectietechnieken (overzicht)
0: Klassieke detectie
1: Op modificatie van klassieke technieken gebaseerd
2: Op immunochemische technieken gebaseerd: ELISA, LIA, Immunoconcentratie
3: Op DNA of RNA gebaseerd
Identificatie- en bevestigingstechnieken
Uitleg + 2 technieken
Bevestiging: Er wordt een beperkt aantal gedefinieerde testen uitgevoerd. (bij sterke vermoeden van de kolonie)
Identificatie: Er wordt een hele reeks aan testen uitgevoerd om de taxonomische identiteit (genus & soort) te bepalen.
Technieken: PFGE & WGS
Alternatieven voor een telplaat (Telmethoden)
Petrifilm
Chromogene substraten/agar (Telmethoden & Detectietechnieken)
Kleurvorming bij afbraak van enzymen of door reactie met bepaalde microbiële metabolieten
Fluorogene substraten/agar (Telmethoden & Detectietechnieken)
fluorescerende stof waar te nemen onder een UV lamp bij splitsing of reactie met bacteriële metabolieten
Op MPN gebaseerd (Telmethoden)
Most probable number.
1) verschillende verdunningen tellen
2) schatting maken van het meest waarschijnlijke aantal MO/gram of ml.
Impedantiemeting (Telmethoden: op metabole activiteit gebaseerd)
Via elektrische geleiding wordt de metabole activiteit gemeten.
Op metabole activiteit gebaseerd (Telmethoden)
a: Tellen met ATP-meting
b: Impedantiemeting
c: Turbidimetrie
Turbidimetrie (Telmethoden: op metabole activiteit gebaseerd)
Het meten van troebelheid
qPCR: 3 fasen (Telmethoden)
1: Concentreren van de bacteriën in het monster door membraanfiltratie
2: lysis, DNA extractie en zuivering
3: Vermenigvuldiging van specifieke DNA fragmenten met PCR en real-time kwantificering van het gevormde DNA met een probe
Detectietechnieken (definitie)
Kwalitatieve methoden die grensreacties of presence/absence testen worden genoemd.
