Práctica 10 Flashcards
(39 cards)
¿Cuál es el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR)?
- saber si el ADN está presente
- determinar la cantidad de moléculas presentes inicialmente en la muestra
¿Cuáles son las aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR)?
Análisis genómico y de expresión génica
Técnica en el lab de diagnostico clínico
Usando ADN genómico como molde para la amplificación, la qPCR se puede usar en el:
Diagnóstico de enfermedades infecciosas determinando los niveles de patógenos específicos en varios tejidos
¿Para que sirve la qPCR en el laboratorio de diagnóstico molecular?
- detección de aneuploidías
- diagnóstico de enfermedades genéticas (Parkinson)
¿Para que sirve la qPCR en microbiología?
- detectar y cuantificar contaminantes microbianos
¿Para qué se puede utilizar la transcriptasa inversa?
Generar una plantilla de ADN complementario (ADNc) para reacciones de qPCR; retro transcripción - qPCR
¿Para qué sirve la PCR convencional?
- Detecta la presencia del ADN al que reconocen el par de primers/cebadores
- Determinación de los tamaños de los productos de amplificación mediante electroforesis en gel
Si la secuencia blanco no está en el ADN:
No aparecerá ningún amplicón en el gel de agarosa
¿Qué es el amplicón?
Producto amplificado
Si en la muestra hay una sola molécula de ADN que contiene la secuencia blanco:
La amplificación en 25 - 30 ciclos es suficiente para generar amplicones detectables mediante electroforesis en gel
Texto página 80
Diferencia entre qPCR y PCR convencional:
La qPCR permite detectar y medir la acumulación del producto amplificado a medida que avanza cada uno de los ciclos de la reacción en tiempo real y determinar el número de copias inicial con precisión y alta sensibilidad
¿En la qPCR cómo se determina la cantidad de ADN molde original en una muestra?
Al examinar los ciclos térmicos iniciales antes de alcanzar la meseta de amplificación
Se hace midiendo la fluorescencia emitida por un reactivo adecuado que refleja la cantidad de producto amplificado en cada ciclo
Señal fluorescente detectable, número de ciclo en el que esto ocurre se denomina:
Ciclo umbral o Ct
¿Qué determina el ciclo umbral o Ct?
Por la cantidad de moléculas molde presentes al comienzo de la reacción
¿Qué es un Ct bajo?
Una gran cantidad de moléculas molde requerirá pocos ciclos de amplificación para acumular suficiente producto para dar una señal fluorescente por encima del fondo
¿Qué es un Ct alto?
Una cantidad pequeña de moléculas molde requerirá más ciclos de amplificación para que la señal fluorescente se eleve por encima del fondo
¿Qué es el SYBR Green I?
Producto químico fluorescente que permite monitorear la amplificación de la secuencia blanco
Se une a dsDNA, exhibe fluorescencia de 1,000 veces mayor que cuando esta libre en solución
¿En qué consiste el paso de excitación?
El instrumento ilumina todos los pocillos de la placa, excitando los fluoró foros en cada reacción
¿En qué consiste el paso de emisión?
Los fluróforos emiten luz de una longitud de onda mayor de la que absorben al excitarse y la parte óptica del instrumento la filtra dentro de cierto rango de longitudes de onda
¿En qué consiste el paso de recolección?
El instrumento ensambla una representación digital de la fluorescencia recolectada durante un intervalo de tiempo fijo. El software almacena la imagen fluorescente sin procesar para su análisis
La principal desventaja del SYBR Green I es su:
Falta de especificidad. Dado que se unirá a cualquier ADN de doble cadena (dsDNA)
¿Cuál es el principio de la curva de desnaturalización?
La temperatura aumenta desde una temperatura baja donde todas las moléculas son doble cadena hasta una temperatura alta que provoca la disociación/desnaturalización de las hebras
A medida que el dsDNA se desnaturaliza, se libera SYBR Green I y se observa una disminución de la fluorescencia: ¿V o F?
Verdadero
