Práctica 11 Flashcards
(13 cards)
¿Qué es un primer o cebador?
Es un oligonucleótido corto de cadena sencilla complementario al ADN diana que provee de un extremo 3´OH libre a la ADN polimerasa para que ésta lleve a cabo la síntesis/extensión del ADN a partir de ese sitio específico dentro de una secuencia más extensa
Los primers o cebadores son usualmente de 18 a 25 nucleótidos (nt) de longitud y son capaces de un reconocimiento altamente especifico de un sitio único en un genoma de millones de pares de bases: ¿V o F?
Verdadero
Longitud del genoma humano:
3.2x10^9 pares de bases
En la PCR los primers:
Flanquean y definen la región que será amplificada
Factor más importante que determina la amplificación específica de la secuencia blanco:
Diseño de los primers
Dado que diferentes partes de los cromosomas pueden compartir cierta similitud de nucleótidos debido a regiones homologas o coincidencias fortuitas:
No se deben de emplear estás regiones para el diseño de los primers evitando así amplificaciones inespecíficas
Falta de complementariedad perfecta de la secuencia blanco con los extremos 3´ de los primers afecta más la especificidad de:
La amplificación que los malos apareamientos hacia el extremo 5´ de los primers
¿Qué es la temperatura de fusión (Tm)?
Es la temperatura a la cual una doble cadena de ADN se desnaturaliza
Los primers deben tener Tm similares y…
Un contenido de G/C equilibrado, evitando auto complementariedad y auto complementariedad 3´
¿Qué es la autocomplemetariedad?
Es la probabilidad de que el cebador se una a sí mismo y al otro cebador del par en cualquier punto a lo largo de su secuencia, es un predictor de la formación de estructuras secundarias de horquilla (tallo - burbuja/hairpin loop)
¿Qué es la auto complementariedad 3´?
Es la propiedad de que el cebador se una a sí mismo y al otro cebador del par en el extremo 3´, es un predictor de la formación de dímeros de primers
¿Qué es el software PRIMER - BLAST?
Permite el diseño y análisis de primers para PCR
PRIMER - BLAST cuenta con:
- Un módulo para el diseño de los primers:
PCR template, primer parameters, exon/intron selection - Un módulo para verificar la especificidad de los primers por la secuencia blanco: primer pair specificity checking parameters
