Purificación y Análisis de Ácidos Nucleicos Flashcards
(40 cards)
Factores que determinan el análisis de Ácidos Nucleicos
- Concentración
- Pureza
- integridad
De que depende la elección del método mas adecuado para el análisis de A. N.
- Tipo de muestra
- Tipo de AN (ARN o ADN)
- Tipo de análisis que se realizara (aplicación)
Ejemplos de métodos físicos de lisis (menciona mínimo 3 o eres gei)
- Trituración manual
- Homogenización mecánica por alta presión
- Homogenización en solución
- Molienda con perlas de vidrio
- Sonicación
- Congelación y descongelación
Métodos químicos de lisis
- Detergentes (SDS, CTAB, etc.)
- Agentes desnaturalizantes
SDS o Dodecil sulfato de Sodio, funciona como:
- Disuelve lípidos de la membrana celular y nuclear
- Desnaturaliza proteínas que están unidas al ADN como las histonas
CTAB o Bromuro de cetiltrimetilamonio
Rompe membranas, elimina polisacáridos y desnaturaliza proteínas, es mas útil para extraer ADN de tejidos vegetales
Tritón X-100, función:
Lisis celular, disuelve lípidos de membrana, sin desnaturalizar completamente proteínas.
Tween-20, función:
- Rompe parcialmente la membrana celular
- No desnaturaliza proteínas ni enzimas
Tiocianato de guanidina, función:
Compuesto caotrópico, desnaturaliza completamente proteínas, incluidas enzimas como nucleasas.
Características del Tampón Tris-HCl (Tris hidroximetilaminometano)
- Evita cambios del pH durante la lisis celular
- Inactiva nucleasas, protege al ADN
- Se mezcla con componentes como (EDTA, SDS, CTAB)
El tampón Tris-HCl, puede usarse como:
- Tampón de lisis celular
- Tampón de resuspensión de ADN
- Tampón de carga para electroforesis
Características del Tampón fosfato-salino (PBS, buffer fosfato salino)
- Se usa para lavar tejido o células antes de iniciar la extracción, eliminando: Sales, proteínas, etc.
- Mantiene el pH estable
- Se usa para preparar muestras antes de la lisis
Métodos Enzimáticos de lisis:
- Lisozimas
- Liticasas
- Quitinasas
- Proteasas
- DNAsas
- RNAsas
Características del Etilendiaminotetraacetato (EDTA)
- Agente quelante, secuestra iones divalentes como Mg+2 inhibiendo nucleasas y protegiendo al ADN
Características de Proteinasa K
- Degrada proteínas estructurales asociadas al ADN
- Rompe membrana celulares y nucleares
- Degrada ADNasas y ARNasas
En que consiste el proceso de Salting out?
Consiste en añadir concentraciones altas de sal (Acetato de sodio o Cloruro de sodio), lo que reduce la solubilidad de las proteínas, provocando que se desnaturalicen y precipiten, mientras el ADN permanece en fase acuosa.
En que consiste la extracción A.N. con Fenol-Cloroformo
Técnica que separa ADN o ARN (fase acuosa) de proteínas y lípidos (Fase orgánica).
Método de extracción de ADN plasmídico clásico y rápido:
Lisis alcalina.
Que componentes se usa para la extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina?
- SDS y NaOH para romper bacterias y desnaturalizar macromoléculas.
Características de la Extracción semi-automatizada: Kits comerciales
- Facilidad de uso
- requiere mínima manipulación, reduce errores y contaminación
- Rapidez en el tiempo de extracción
Aplicaciones del ADN metagenómico
- Análisis de microbiomas
- Identificación de nuevos genes, enzimas o rutas metabólicas
- Estudios de biodiversidad microbiana
- Diagnostico clínico, agroindustria, biotecnología ambiental
QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit (Qiagen) es usado para:
- Heces humanas/animales
- Apliaciones en microbioma intestinal, diagnostico fecal
- Tipo de lisis mecanica con perlas zirconia
PowerSoil DNA Isolation Kit (Qiagen), es usado para:
- Suelo, sedimentos, raíces, polvo:
- Aplicaciones en diversidad del suelo, microbiología ambiental
- Tipo de lisis mecánica con perlas cerámicas.
PowerWater DNA Isolation Kit (Qiagen), es usado para:
- Agua (filtrada en membrana de 0.22 um)
- Aplicaciones en vigilancia ambiental, microbioma acuático.
- tipo de lisis química + mecánica (filtro + bead tube)
