Vectores de clonamiento y expresión Flashcards
(25 cards)
¿Qué es un vector?
Moléculas de ADN con la capacidad de aceptar fragmentos de ADN, las cuales replican dentro de células huésped una vez insertados.
¿Cuáles son las características fundamentales de un vector de ADN?
a. Poseer varios sitios de restricción -> Permite la inserción de los fragmentos de ADN que haya que clonar.
b. Deben ser introducidos en células huésped -> Lábiles a la introducción en otras células, para permitir la replicación independiente del ADN del vector y de cualquier fragmento de ADN que transporte.
c. Debe poseer gen o genes marcadores -> Para diferenciar las células huésped que incluyen a los vectores de las que no. Usualmente son genes de resistencia a antibióticos o gen de una enzima.
d. Facilidad de aislamiento del vector y su fragmento de ADN -> Recuperables de la células huésped, con el fin de recuperar el ADN clonado y aplicarlo en diversos ámbitos.
Usos comunes de los plásmidos:
a. Producción en masa de proteínas -> para su aislamiento y purificación.
b. Producción de proteínas que brillan -> trazabilidad dentro de una célula.
c. Ingeniería genómica.
Producción de virus sintéticos.
¿Cuáles son los tipos de vectores genéticos?
a. Vectores no virales:
i. Plásmido.
ii. Plásmido + liposoma
b. Vectores virales:
i. Adenovirus
ii. Virus adenoasociados (AAV, Adeno associated virus)
iii. Lentivirus
Retrovirus
Conceptos clave sobre: Vectores virales.
a. Capacidad máxima del cassete de expresión (Kb): Cuánto material genético en kb es capaz de transportar.
b. Inmunogenicidad del vector: Es capaz de activar (o no) una respuesta inmunitaria.
c. Integración cromosómica: El ADN transferido es capaz de integrarse en el genoma del huésped.
d. Expresión: Puede ser transitoria (temporal) o persistente (duradera).
Características de los vectores virales según tipo de vector:
a. Adenovirus:
i. Capacidad máxima del cassete de expresión: 7 - 8 Kb.
ii. Activador de inmunogenicidad: Alto activador.
iii. Integración cromosómica: No.
iv. Expresión: Transitoria.
v. Adicionalmente: Pobre eficiencia de transducción. Así mismo, la cantidad de información genómica puede incrementar si se remueven genes virales; sin embargo, para ello requerirá de un virus helper o plasmid helper.
b. AAV (Adeno associated virus):
i. Capacidad máxima del cassete de expresión: 4 - 5 Kb.
ii. Activador de inmunogenicidad: Bajo activador.
iii. Integración cromosómica: No.
iv. Expresión: Persistente en células no divisorias.
v. Adicionalmente: En terapia génica, su expresión contempla 1 - 3 semanas.
Características de los vectores virales según tipo de vector II:
a. Retrovirus:
i. Capacidad máxima del cassete de expresión: 8 Kb.
ii. Activador de inmunogenicidad: No produce R.I.
iii. Integración cromosómica: Es capaz de integrar el ADN transportado al genoma del huésped.
iv. Expresión: Persistente.
v. Adicionalmente: Debido a la integración cromosómica, existe el riesgo por mutagénesis insercional.
b. Lentivirus:
i. Capacidad máxima del cassete de expresión: 8 Kb.
ii. Activador de inmunogenicidad: Ninguno.
iii. Integración cromosómica: Sí.
iv. Expresión: Persistente.
Adicionalmente: Riesgo teórico al poseer componentes del VIH, riesgo por mutagénesis insercional.
Elementos de un vector de clonación plasmídico y de expresión plasmídico:
- Vector de clonación plasmídico: ORI (origen de replicación), sitio de clonación múltiple, gen marcador.
- Vector de expresión plasmídico: ORI, región promotora, sitio de clonación múltiple, gen marcador.
Diferencia entre vector de clonación y expresión. ¿Por qué?:
a. El vector de expresión posee región promotora.
b. Tener en cuenta:
i. Vector de clonación -> Multiplicas o mantener un fragmente de ADN.
ii. Vector de expresión -> Producir una proteína a partir de un gen insertado.
La adición de una región promotora permite iniciar y regular la transcripción de un gen, dirigiendo así la producción correspondiente a una proteína.
¿Qué es la incompatibilidad de plásmidos?
a. Principios: Los plásmidos cuentan con un ori o un sistema de control de replicación.
Se refiere a que dos plásmidos no pueden coexistir en una misma célula durante muchas generaciones, debido a la competencia por los recursos dentro de la misma células; por lo que, uno “se replica mejor” y “desplaza al otro”, provocando pérdida del objetivo inicial de la inserción de ambos plásmidos.
Mencionar: Promotores Eucariotas: En mamíferos.
a. CMV: (Citomegalovirus humano)..
i. Usado para expresión general -> RNAm (transcripto).
ii. Expresión constitutiva: El gen se expresa constantemente, no requiere señales externas.
iii. Puede contener regiones potenciadoras (enhancers). Además, puede ser silenciado en algunas líneas celulares.
b. EF1a: (Elongation Factor 1 alpha humana.
i. RNAm -> Expresión constitutiva.
ii. Expresión constante independiente del tipo de célula o fisiología.
c. SV40: (Virus simian vacuolating)
i. Expresión general (Constitutiva) -> RNAm
ii. Puede incluir enhancer.
d. ADH1: En levadura. Alcohol deshidrogenasa I.
Expresión general (Reprimido por Etanol) -> RNAm.
Promotores eucariotas: EN PLANTAS.
a. CaMV35S: (Cauliflower Mosaic Virus)
i. Expresión general (constitutiva) -> RNAm.
ii. Activo en dicotiledóneas, menor actividad en monocotiledóneas. Posee poca actividad en células animales.
b. Ubi: (Ubiquitina)
i. Expresión general (constitutiva) -> RNAm.
OFRECE GRAN EXPRESIÓN EN PLANTAS.
Promotores procariotas:
a. Trp: Promotor del operón triptófano
b. Lac: Promotor del operón Lac.
c. T7: Del Bacteriófago T7
i. Expresión constitutiva pero requiere T7 RNA pol.
ii. Principal uso: Transcripción in vitro/expresión general.
1) Solo si dos promotores de fagos diferentes se hallan en distintas orientaciones en el gen.
d. T7lac: Del bacteriófago T7 más operones lac.
i. Altos niveles de expresión génica.
Requiere T7 RNA polimerasa, el cuál está controlado por operón lac.
Con respecto a los promotores eucariotas: Si se requiere de una expresión duradera y consistente en varios tipos de líneas celulares. ¿Qué promotor emplearía?
EF1a: Permite expresión constante independientemente del tipo de células o fisiología.
Con respecto a los promotores eucariotas: Si se requiere de una expresión consistente en plantas. ¿Qué promotor emplearía?
a. CaMV35S: Virus mosaico del coliflor. Activo en dicotiledóneas, menor actividad en monocotiledóneas.
b. Ubi: Promotor de la ubiquitina en Zea mays.
¿Qué es un plásmido?
a. ADN circular, posee capacidad de replicación independiente al ADN cromosómico. En bacterias, arqueas y algunos eucariotas.
b. Empleado para introducir y modificar material genética; sin embargo, naturalmente confiere ventajas mediante conjugación o transformación entre bacterias.
¿Cómo distinguir que plásmido escoger en base a ORI?
a. De acuerdo al objetivo:
i. Expresividad:
1) Alta expresión de un gen: pUC (>200 copias) o pJPA13 (-240 copias).
2) Baja expresión: Bajo número de copias, F1 (1 - 2 copias) o Psc101 (-5 copias).
ii. Varios plásmidos en la misma célula: Plásmidos con replicones diferentes, evitando la incompatibilidad de plásmidos.
iii. Plásmidos inducibles o movibles: R6K (5 - 250 copias) pues requiere proteínas específicas para replicar, lo que es útil en replicación específica.
Enzima de restricción Tipo IIP:
a. P de palindrómico jeje.
b. Lugar de corte: Dentro del sitio de reconocimiento.
c. Corte: Romo u cohesivo.
d. Aplicación: Clonación convencional.
Son: EcoRI, HindIII, BamHI
- Enzima de restricción TIPO IIS:
a. S de sin palindromismo jaja (no es palindrómico).
b. Lugar de corte: Fuera del sitio de reconocimiento (a una distancia definida).
c. Tipo de corte: Extremos cohesivos.
d. Aplicación: Ensamblaje tipo Golden Gate (Puerta dorada, sin cicatrices).
e. Son: BsaI, BsmBI, SapI.
¿Diferencia(s) entre tipos de enzimas de restricción IIP y IIS?
a. Tipo IIS es no palindrómico, corta fuera del sitio de reconocimiento y es empleado en ensamblaje Golden Gate por no producir cicatrices debido a lo anterior mencionado.
Tipo IIP reconoce secuencias palindrómicas, corta dentro del sitio de reconocimiento.
Tipo IIS: ¿Por qué es útil que corte fuera del sitio de reconocimiento?
a. Permite hacer clonaciones sin cicatriz - Golden Gate.
b. Protocolarmente:
i. i. Se coloca un sitio BsaI (enzima de restricción tipo IIS) fuera del gen que se desea insertar. El gen es digerido, y el vector receptor también contiene sitios BsaI flanqueando su región de inserción. Al ser ambos cortados por BsaI, se eliminan algunos pares de bases lejos de los sitios reconocidos, dejando expuestos extremos cohesivos diseñados específicamente, que son distintos entre ambos extremos. Esto evita la religación del vector consigo mismo y permite que el gen digerido se inserte en la región deseada. Además, los sitios de reconocimiento BsaI no quedan en el producto final, lo que da como resultado un clon “limpio”, sin marcas de restricción visibles en el inserto.
c. En contraste a IIP:
i. Estas enzimas generan siempre los mismos extremos cohesivos (por ejemplo, EcoRI deja un overhang de 5’ AATT). Si no se trata el vector previamente (por ejemplo, con desfosforilación), puede religarse consigo mismo con facilidad, lo que reduce la eficiencia de clonación. Además, los sitios de restricción permanecen en el producto final, lo cual puede ser inconveniente en algunos diseños de clonación.
¿Cuáles son los tipos de ensamblaje y función?
a. Golden Gate: Ensambla múltiples fragmentos de ADN en un solo paso con enzimas tipo IIS. No deja cicatrices.
b. Gateway: Transferir genes entre diferentes vectores usando recombinación dirigida. Deja cicatrices, por empleo de sitios específicos (att).
c. Gibson: Ensambla múltiples fragmentos de ADN sin necesidad de enzimas de restricción ni sitios específicos. No deja cicatrices. Emplea homología de solapamiento.
Componentes del ensamblaje: Golden Gate.
Enzimas de restricción tipo IIS (ej. BsaI, BsmBI): Cortan fuera del sitio de reconocimiento → generan extremos cohesivos únicos y dirigidos.
Ligasa T4: Une los fragmentos de ADN mediante los extremos cohesivos complementarios.
Fragmentos de ADN: Cada fragmento contiene los sitios tipo IIS adecuados en sus extremos.
Vector de destino: Recibe los fragmentos ensamblados; también lleva sitios tipo IIS para insertar en posición precisa.
Ciclo térmico: Alterna digestión (37 °C) y ligación (16 °C) para facilitar múltiples cortes y pegados en una sola reacción.
- Componentes del ensamble: Gateway.
Sitios attB (bacteriano), attP (lambda), attL (attB x attP), attR (vector destino): Sitios de recombinación del sistema del fago lambda. Dirigen la recombinación específica.
Enzimas BP Clonase y LR Clonase: Catalizan recombinación entre sitios específicos (attB×attP y attL×attR, respectivamente). Son: Int, Xis y factor integrador.
Integrasa (Int):Promueve la recombinación entre attB y attP (fase BP).
Excisasa (Xis): Ayuda en la recombinación inversa entre attL y attR (fase LR).
IHF** (factor integrador): Facilita el emparejamiento de sitios de recombinación.
Vector Donor (con attP): Recibe el inserto para generar el vector de entrada (Entry clone).
Vector de destino (con attR): Recibe el fragmento desde el vector de entrada para formar el vector de expresión.
Inserto con sitios attB: Fragmento de ADN a clonar. Puede tener ORFs, genes, promotores, etc.
