Strategisk proteinrening Flashcards
Varför vill vi isolera proteiner?
- Struktur
- Funktion
- Enzymkinetik
- Studera posttranslationa modifications (PTMs)
- Producera/rena fram antikroppar
- Terapi - proteinläkemedel
Vilka egenskaper hos protein är bra att tänka på?
- Storlek
- Hydrofobicitet
- Biologisk aktivitet
- Unik sekvens
- Laddning
- Posttranslationella modifieringar
Vad är målet med strategisk proteinrening?
- Hitta den bästa vägen från startmatrialet till slutprodukt
- Att få ett högt utbyte av en biologisk aktivitet från proteinet
- Att proteiner har en hög renhet
EX: Utgå från 1 KG lever och utvinna ca 30 mg ren aktiv substans
VAd ska du tänka på vid strategisk proteinrening?
- Uttnyttja olika egenskaper för att få proteinet rent
- Arbeta vid +4
- Arbeta kontinuerligt. kromatografi över natt
- Skydda proteinet från degradering
Övergripande princip för strategisk proteinrening?
- Preparera, extrahera och få proteinet i vattenlösning (speciellt om de är ett membranprotein)
- Isolera, koncentrera och stabilisera
- Få bort orenheter/andra proteiner
- Addera steg för ytterligare renhet
Hur ska du planera inför proteinrening?
•Skaffa kunskap om
–Proteinets egenskaper; pI, storlek
–Lokalisation. Är det ett membranprotein?–Hur får man proteinet i vattenlösning?
•Analys för att följa proteinet under reningsarbetet–snabb
–specifik
•Använd olika tekniker i de olika reningsstegen
–Storlek, laddning, hydrofobicitet, ligandaffinitet
Vad gör detergent med cellmembran?
Används för att solubilisera cellmembran och bibehålla membranproteiner i lösning
Vilka steg finns vid proteinrening?
•Val av utgångsmaterial
- rikt på det protein man vill renframställa
•Överföring av proteiner till vattenfas
-Proteinet bör finnas i lösning för att kunna renas vidare -skydda proteiner för degradering
•Val av renings-metodik:
- olika typer av kromatografi eller affinitetsreningar
•Verifiering av renhet:
-aktivitet -absorbans
- gel-elektrofores / masspektrometri
- Antikropps-detektion (Western blot)
•Överföring av proteiner till vattenfas
- proteiner i kroppsvätskor är i vattenfas
- proteiner i celler måste sönderdelas mekaniskt eller kemiskt
Skydda proteiner från degradering!
(Ofta tillsätts proteas-inhibitorer till proteinlösningar)
Vad gäller proteiner i celler/vävnad så måste dessa sönderdelas. Hur kan du göra detta?
Mekaniskt
- Miska i homogenisator
- Skaka med glaspärlor/metallkulor
- Sonikering, ultraljud
Kemiskt
- Organiskt lösningsmedel (upplösning av memebran
- Detergenter
- Enzymatisk behandling (ex. lysozyme som bryter ned bakteriers cellvägg)
- Hypoton sprängning
Vilka separationstekniker används vid proteinrening?
- Centrifugering
- Filtrering
- Kromotografi
- Avsalning
- Precipitering
- Dialysering
- Size exclusion
- Avsalningskromatografi
Evaporering av vatten (speedvac, frystorkning)
Hur fungerar centrifugering?
Vad är g talet för något?
Kan oblans uppstå i en centrifug?
Rotation av rotorn genererar en centrifugalkraft där:
- Partiklar med högst densitet hittas i botten av centrifugröret
- Lättare partiklar bildar tunna skikt ovanför
g-talet anger hur stor kraft partikeln utsätts för och beror av rotoms radie samt cenrifugens varvtal.
Obalans kan uppstå om bägarna inte lastas rätt. Se bild hur de ska lastas
Vad för typer av centrifuger finns de?
Vad för typer av kromotografi finns de?
- Jonbytes kromatografi
- Gelfiltrering
- Affinitetskromatografi
Vad menas med isoelektrisk punkt?
Aminosyror av “dubbel natur” dvs både syra och bas är beroende av pH i lösningen. Vid ett visst pH är aminosyrans nettoladdning 0. Detta kallas isoelektriskpunkt (pI)
????
Hur fungerar jonbyteskromatografi?
- Separerar molekyler med avseende på laddning.
- Anjonbytare- separerar proteiner med negativ-laddning
- Katjonbrytare - separerar proteiner med positiv laddning.
- Eluering vid ändras pH eller med salt
Hur fungerar gelfiltering?
Separerar med avseende på storlek
Hur kan du avslata?
Hur fungerar affinitetskromatografi?
Användandet av cellkulturer och rekombinant uttryck av proteiner möjliggör introduktion av utvalda aminosyrasekvenser för att underlätta framrening och detektion t.ex- his-tag-
De bindande nickel-komplexet sitter ofta konjugerad till magnetiska kulor. Detta möjliggör snabb separation och tvätt för att få bort ospecifik binding
Hur kan du rena fram glykopeptider?
Genom hydrophilic interaction ion kromatografi
