T4 - Aplicaciones de los cultivos celulares Flashcards
(106 cards)
1
Q
¿Por qué puede interesar realizar un análisis del ciclo celular?
A
Para ver el efecto de un compuesto determinado: ¿aumenta o disminuye la apoptosis? ¿La prolifereación?
2
Q
Realizar un análisis del ciclo celular puede resultar interasante para ver el eecto de nuestro tratamiento sobre el cultivo de órganos que hemos realizado.
A
F
En un cultivo de órganos no hay proliferación, no tiene sentido analizar el cluclo celular.
3
Q
El punto R es un punto de no retorno, a partir del cual la célula toma la decisión irreversible de dividirse si las condiciones son favorables.
A
V
4
Q
Cuando se completa la fase M, la célula entra en fase G0 para empezar un nuevo ciclo celular.
A
F
G0 supone la salida del ciclo (la célula se diferencia)
Al salir de la mitosis la célula está en fase G1, desde esta se “toma la decisión” de si seguir con un nuevo ciclo o entrar en G0.
5
Q
EN la fase S la célula tiene una cantidad 4n de DNA, pues es la etapa de replicación
A
F
Tiene enntre 2 y 4 n, si se está replicando quiere decir que aún no se ha duplicado commpletamente.
6
Q
Un análisis del ciclo celular nos permite saber en qué etapa de la mitosis se encuentra la célula
A
F
A partir de G2 y hasta que se completa la citocinesis, las células tienen 4n en todo momento, luego es imposible distinguirlas (las agrupamos como G2/M)
7
Q
Para analizar el ciclo celular mediante cel citometro de flujo se realiza un marcaje del DNA y se mide la colorimetría
A
F
Las células se tratan con un fluoróforo que se una al ADN como la cromomicina A3, bromuro de etidio, Hoechst 33342, yoduro de propidio, … Estos compuestos emiten fluorescencia cuando se unen a las hebras de ADN, pero no cuando están libres.
8
Q
Los fluoróforos que se unen al DNA lo hacen en partes diferentes: el surco mayor, el menor, se intercalan entre bases, se unen al fosfato…
A
V
9
Q
Qué diferentes dases del ciclo celular podemos determinar mediante citometría de flujo?
A
- G0/G1 –> cantidad de DNA = 2n
- S –> cantidad de DNA = 2-4n
- G2/M –> cantidad de DNA = 4n
- Apoptosis (no es parte del ciclo) –> cantidad de DNA <2n
10
Q
A la hora de realizar una sincronización, los métodos físicos de selección proporcionan mejores resultados debido a que no alteran las células
A
F
No las alteran pero eso supone que pocas células estarán en la fse deseada
11
Q
La técnica de separación mitótica cnsiste en agitar la placa para desenganchar las células en interfase, conservando así adheridas las células en mitosis
A
F
En el momento de la mitosis las células están menos
adheridas (cambio forma más redondeadas) y agitando se pueden desenganchar.
12
Q
Estoy realizando un estudio con linfocitos, y quiero estudiar los efectos de un fármaco sobre los linfos en división… ¿puedo usar la separación mitótica para sincronizar el cultivo?
A
NO porque solo es apta para células que crecen en monocapa, ya que se fundamenta en la adhesión de las células a la placa, y los linfocitos son células que crecen en suspensión
13
Q
La separación mitótica es una técnica con un rendimiento del 90-99%.
A
Falso
Da resultados buenos (90-99% de población pura → es decir de las células que has pillado, el 90% están en mitosis), pero con bajo rendimiento, ya que solo hay un 5-8% de células en división.
14
Q
Sincronizando un cultivo mediante citometría de flujo… ¿Cómo controlas que no haya células en G0?
A
- Manteniendo condiciones pro-proliferación (poca confluencia, suero…)
- Tener en cuenta que al estar diferenciadas el side scatter es mayor y tiene proteínas de superficie (unir Anticuerpos)
De todos modos nos importa poco porque se confunde con G1, y G1 no interesa mucho.
15
Q
La citometría de flujo únicamente permite separar bien las células en G1
A
V
Las células en S y en G2+M son más parecidas.
16
Q
Las técnicas de separación por tamaño o densidad tienen un rendimiento muy bajo.
A
V
De bido a lo pequeñas que son las difere cias entre fases.
17
Q
¿De qué forma se pueden separar células por su tamaño/densidad?
A
- Centrifugación en gradiente de densidad
- Técnica que consiste en una cánula que llega al fondo del tubo y va introduciendo un medio de flotación muy denso. Este empuja el medio de cultivo con las células. Tiene un grifito que va haciendo caer las células en un pocillo programado para que cada X gotas cambie de pocillo (habrá pocillos vacíos, otros con células)
18
Q
La restricción de calcio consiste en mantener las células durante 48h en un medio libre de calcio
A
F
Pasan de un medio 1,35 mM de Ca2+ a uno 10uM de calcio
19
Q
Tenemos unas células transformadas…, enumera técnicas de restricción para realizar un estudio que requiere del bloqueo el ciclo celular
A
Restricción de Ile o de Suero pero NO de Ca2+ (porque las células transformadas son independientes de los requerimientos de Ca2+)
20
Q
La Histidina es un aminoácido es esencial, su falta provoca que las células no puedan proliferar. En eso se basa la técnica de restricción: deja las células bloqueadas en las fases G0 y G1.
A
F
LEUCINA
21
Q
Ninguna célula puede sobrevivir en un medio libre de suero, por ello la restricción de suero consiste en poner un medio al 0,5-1% de suero
A
F
Hay células cancerosas que SÍ sobreviven con 0% de suero
22
Q
Las técnicas de bloqueo del ciclo celular consisten en añadir al cultivo un compuesto que inhiba la síntesis del DNA durante 16h.
A
F
Técnica de DOBLE BLOQUEO.
Las de bloqueo SUSTRAEN algo del medio.
23
Q
¿OBjetivo de realizar un doble bloqueo?
A
Dejar ltodas las células bloqueadas en G1/S (justo en el punto entre ambas fases) para que al eliminar el compuesto, todas entren en S de forma sincronizada
24
Q
Es posible realizar un doble bloqueo SOLO con hidroxiurea/timidina
A
V
Tras un 1º bloqueo, se ponen las células en un medio normal completo durante un tiempo suficiente para que todas las células completen la fase S (8-10 horas) pero que no vuelvan entrar en dicha fase. Se vuelve a realizar el bloqueo con hidroxiurea o timidina y el 100% de las células estarán sincronizadas.
25
Aún siendo tratada para realizar una fusión celular, las células solo son capaces de fusionarse una de cada 10 millones de veces.
F
| Esa es la capacidad de fusionarse de forma natural.
26
Un heterocarionte es la célula resultante de la fusión de otras 2, que combina las características de las células originales.
V
27
Al producir híbridos somáticos se pueden producir mitosis aberrantes si no se distribuye igual el material genético, ya que se tiene más, y se puede perder algunos cromosomas
V
28
Un fusogen es un gen que, al expresarse, promueve la fusión celular
F
## Footnote
No es un gen, es un compuesto como el polietilenglicol, que afecta a la permeabilidad de memmbrana, lo que incrementa la frecuencia de fusión de 1/10millones a a/10000
29
30
¿Qué estrategia se usa para aislar los híbridos somáticos obtenidos tras añadir un fusogen al cultivo?
Se usan células con mutaciones puntuales recesivas que permiten sobrevivir en un medio con carencias y después de hace un ensayo de complementariedad.
## Footnote
Suelen ser mutaciones que afecten a la síntesis de nts.
31
La TK (timidina quinasa), la HGPRT (hipoxantina guanina fosforribosil transferasa) y la DHFR (dihidrofolato reductasa) son enzimas que participan en la síntesis de nucleótidos a partir de nases nitrogenadas o nucleósidos, lo que los hace idóneos para mutarlos para la producción de hibridomas.
F
## Footnote
HGPRT y TK sí son síntesis a partir de bases nitrogenadas o nucleósidos; pero DHFR la sintetiza a partir de precusores sencillos.
32
La aminopterina es un inhibidor de la Dihidrofolato Reductasa
V
33
Tras realizar una fusión celular, obtenemos un cultivo que incluye 2 tipos de células: heterocariontes y células parentales (no fusionadas)
F
## Footnote
Sería verdadero si dijera hibridomas y células parentales; pero esos hibridomas son tanto heterocariones (las células que queremos obtener) como homocariontes (fusión de 2 células iguales --> es una célula 4n con 2 juegos 2n idénticos).
34
¿Por qué el medio HAT es un medio de selección de heterocariontes?
Porque contiene aminopterina (inhibidor de DHFR) y carece de hipoxantina y timidina.
Como las células parentales usadas son:
- Una línea -/- para TK
- La otra -/- par HGPRT
Como la aminopterina inhibe la DHFR, en el medio HAT se necesitan ambas enzimas para la síntesis de nts (no pueden obtenerlos del medio).
Los homocariontes y las parentales ni van a poder sintetizar o bien timidina o bien hipoxantina, por lo que van a morir. SOlo las heterocariontes tendrán copias funcionale sde ambas enzimas y podrán sobrevivir.
35
La transducción consiste en inserir material genético en la célula mediante un bacteriófago.
V
36
La transfección consiste en introducir material genético externo por métodos no virales lon que implica no usar ni vectores víricos ni bacteriófagos.
F
## Footnote
Implica no usar un bacteriófago, pero sí se puede usar un vector vírico.
37
- La transfección de células requiere aislar un gen.
- Introducirlo en un vector de expresión para obtener diferentes copias (células procariotas).
- Aislar las copias e introducir el vector en células procariotas en cultivo (células recipientes).
F
## Footnote
Aislar las copias e introducir el vector en células EUCARIOTAS en cultivo (células recipientes).
38
Pon algún ejemplo de aplicación de la transfección celular
- Estudiar la función de la proteína introducida (por sobreexpresión o silenciamiento)
- Inhibir la actividad de una proteína endógena
- Analizar la distribución subcelular de la proteína introducida
- Realizar inmunodetección de proteínas en células vivas
- Estudiar la activación de vías de señalización
Terapia génica
39
Define, diferenciando: transfección, transducción, transformación y conjugación.
Transfección: como término genérico para la transferencia génica, y el más común cuando esta se realiza sobre células animales.
Transducción: transfección realizada por medio de virus, proceso que estos realizan de forma natural sobre distintas células.
Transformación: transfección realizada sobre células no animales (bacterias y eucariotas como hongos, algas o plantas).
Conjugación: proceso natural de transfección entre bacterias (pili)
40
La transformación es la ransferencia génica, cuando esta se realiza sobre células animales.
F
## Footnote
TRANSFECCIÓN
La TRANSFORMACIÓN es una transfección realizada sobre células no animales (como bacterias y eucariotas como hongos, algas o plantas).
Conjugación: proceso natural de transfección entre bacterias (pili)
41
Lo que distingue una transfección celular transitoria de una estable es si el ácido nucleico entra en el núcleo o no.
F
## Footnote
Si es ADN, entra en el núcleo, sea estable o transitoria.
42
En la transfección transitoria el ADN no se inserta en el genoma nuclear, por lo que este ADN exógeno se va perdiendo cuando la célula entra en mitosis.
V
| Al cabo de un tiempo (1-4 días) se degrada por nucleasas
43
Por qué la transfección transitoria de DNA no es estable?
En el núcleo hay nucleasas (muchas exonucleasas).
Debido a las proteínas, la condensación y los telómeros, el DNA genómico está protegido.
No así un fragmento corto de DNA con extremos libres.
44
Para seleccionar las células transfectadas se introduce un gen de resistencia, por ejemplo, a la amplicilina.
F
## Footnote
SÍ se introducen genes de resistencia pero NO a la ampicilina (es un antibiótico para procariotas).
45
Si interesa co-expresar varias proteínas ¿qué método de transfección (transitoria o estable) es preferible?
Transitoria
46
Si interesa una expresión contínua de la proteína ¿qué método de transfección (transitoria o estable) es preferible?
Estable
47
Haz una comparativa ente las ventajas e inconvenientes de la transfección transitoria frente a la estable
La transfección transitoria tiene las **ventajas **de que...
- Elevado nivel de expresión (si entra) sobretodo el mRNA → en cambio la estable da niveles de expresión moderados
- Es fácil co-expresar varias proteínas (puedes meter varios fragmentos, como entran y se quedan por ahí pululando no hacen nada) → complicado en la estable
- Procedimiento fácil , barato y rápido (Mezcla tubo A con tubo B y espera X minutos y en 6h está hecho) → el procedimiento de la estable es laborioso y largo (Debido a la selección clonal, porque el transgen se integra al azar en el genoma).
Los **inconvenientes** de la transitoria...
- Variabilidad en el % de células que expresan (población celular heterogénea) → en cambio la estable da lugar a una población celular clonal que es homogénea
- Obtención de poca proteína dilatada en el tiempo (mucha por unidad de tiempo) → la estable proporciona una producción contínua de proteína e incluo permita almacenar células expresoras (congelar).
- Requiere gran cantidad de vector
48
Un vector de expresión para células de mamífero debe incluir un gen reportero
F
| Puede contenerlo, pero es opcional.
49
Para conseguir una transfección participan 2 tipos de células: procariotas y eucariotas
V
50
¿Qué elementos presenta un vector de expresión para células de mamífero?
- Promotor
- Gen de interés
- Genes de resistencia
- Gen reportero (opcional)
51
¿Por qué un vector de transfección para células de mamífero cuenta con un origen de replicación bacteriano y con un gen de resistencia a antibióticos efectivos contra bacterias?
Porque la amplificación del vector se lleva a cabo en un cultivo bateriano y...
- el origen de replicación en bacterias es necesario para mantenerlo y amplificarlo
- el gen de resistencia e.g. a la amicilina permite seleccionar las bacterias con el plásmido.
52
¿Por qué el promotor usado en los vectores de transfección suele ser vírico?
Porque asegura una expresión elevada
53
# En un vector de transfección
¿Cuál es la función del promotor, el Multicloning site, la señal de poliA y el gen de resistencia?
- Promotor secuencia que controla la expresión del transgen (p.e. pRSV expresión elevada y constitutiva)
- Sitio de clonage: “multi cloning site” MCS (donde se introduce la secuencia de ADN de interés)
- Señal de poliadenilación (finalización del ARN mensajero) de forma natural a los mRNAs se le añade 200-300 As, aquí se añaden pq si el vector queda de forma transitoria no la va a expresar.
- Gen de resistencia a un antibiótico para la selección de las células que han incorporado el plásmido:
(p.e. Neomicina o Higromicina) → se pone en [ ] bajita pq aunque haya resistencia no les gusta (seleccionar las células que expresan el gen).
54
El inconveniente de los genes marcadores o reporteros es que debes matar las células para cuanntificar la señal.
F
## Footnote
Sí en el caso de CAT, luc o beta-gal, pero no en el caso de la GFP.
55
Ña secuencia de los genes reproteros se añade al vector para poder controlar la eficiencia de la entrada de ADN, estudiar la regulación de la expresión de un gen y/o monitorizar la localización subcelular de la proteína.
V
56
La cloranfenicol acetyl transferase (CAT) es una enzima eucariótica que transfiere grupos acetilo del acetil-coenzima A al antibiótico cloranfenicol. El ensayo CAT se realiza añadiendo cloranfenicol radiactivo al medio por lo que se detecta por autorradiografía (Si expresa CAT cabe esperar que tmb la prot de interés).
F
| enzima PROCARIOTA
57
La luciferasa cataliza la oxidación de las luciferinas, reacción que emite luz, la cual es cuantificable mediante un luminómetro
V
58
Al añadir el sustrato de la GFP e incubar unos minutos, puede detectarse fluorescencia de forma proporcional a la proteína de interés.
F
## Footnote
La GFP emite fluorescencia por exposicicón a UV, no requiere un sustrato.
59
La versatilidad de la beta-galactosidasa ha determinado que a día de hoy sea el gen reportero más utilizado.
F
| La GFP se usa más.
60
La GFP es un barril beta conjugado a un fluoróforo que emite a 395 y 509 nm
V
61
La secuencia de Kozak, situada justo tras el promotor, es una secuencia de ARNm que facilita el reconocimiento de la secuencia de iniciación (AUG) durante el proceso de traducción en los eucariotas.
V
62
¿Cuál es el problema de generar una proteínad e fusión con la GFP?
El tamaño de GFT unida a la proteína, dependiendo de la localización subcelular de la proteína… la forma y la estructura de la proteína puede verse alterada (estructura ←→ función). Por tanto va bien para proteínas citoplasmáticas, pq no se tienen que transportar. Aunque siempre y cuando la estructura no se vea alterada. Al final es algo empírico, comprobar si es viable o no.
63
A parte de la GFP, en el mercado existen otras proteínas fluorescentes, clonadas a partir de medusas, anémonas y/o corales
V
64
En una transfección, el vector generalmente entra en la célula por endocitosis
V
65
A grandes rasgos: ¿cuál es la diferencia entre los métodos de transfección químicos y los físicos?
Que en los químicos se acompleja el ácido nucleico a moléculas cargadas positivamente (carriers) que facilitan la entrada a la célula; mientras que los físicos introducen el ácido nucleico directamente, sin mediadores.
66
Haz un listado de los diferentes métodos de transfección
Químicos:
- Lípidos catiónicos
- DEAE-dextrano
- Polietilenglicol
- Coprecipitación con fosfato cálcico
Físicos:
- Biolística
- Microinyección
- Electroporación
- Magnetofección
67
La cloroquina y el DMSO o glicerol son tratamientos que incrementan la eficacia de transfección por coprecipitación con fosfato cálcico o con DEAE-dextrano
V
## Footnote
cloroquina (inhibidor de DNAsas, por tanto aumenta la permanencia del DNA en el medio)
glicerol o DMSO (alteran la permeabilidad de membranas, facilitando la endocitosis)
68
Para la coprecipitación con fosfato cálcico se añade DNA y fosfato cálcio gota a gota
F
## Footnote
Se añade DNA y CaCl2 y luego se añade tampón fosfato (Na3PO4) gota a gota.
69
El método DEAE-dextrano consiste en la formación de complejos DNA-anticuerpo cargado positivamente cuya endocitosis se ve favorecida
F
## Footnote
EL DEAE-DEXTRANO ES UN POLÍMERO, NO UN ANTICUERPO.
70
El DEAE-dextrano se usa exclusivamente para transfecciones transitorias
V
## Footnote
La liberación del polímero respecto del DNA es muy difícil. Cuesta que entre en el núcleo y si lo hace NUNCA se va a integrar en el genoma.
71
La trasfección mediante PEI (polietilenimina) sirve para todo tipo celular y todo tipo de trasfecciones
V
72
¿Por qué todos los métodos químicos se basan en el uso de moléculas catiónias?
- El DNA es negativo
- La Superfície celular tmb (potencial de membrana, la cara externa es la que tiene carga negativa)
Así 1º se favorece la formación complejo DNA-carrier → 2º la formación del endosoma.
73
La lipofección, generalmente da lugar a la captación de DNA por endocitosis
F
## Footnote
Los lípidos catiónicos se fusionan con la membrana, liberando el cargo directamente al ditoplasma
74
Excepto la lipofección (que tiene el efecto opuesto) todos los méetodos químicos de transfección van reduciendo la superfície de la membrana plasmática lo que da lugar a células con un exceso de turgencia
V
## Footnote
Los otros métodos químicos captan el ácido nucleico por endocitosis, peridendo un fragmento de membrana (este se recicla, pero cuando la tasa de captación es muy elevada, no da a basto).
75
La cantidad de DNA usada para una transfección es directamente proporcional a la eficiencia de transfección
F
## Footnote
NO necesariamente, también depende del tipo de DNA y de célula, de si es linear o está plegado
76
La relación de carga óptima del reactivo de transfección respecto del ADN es 2:1 o 3:1
V
## Footnote
Aunque puede encontrarse entre 1:1 y 4:1 (el requisito es que la carga positiva sea mayor o igual a la negativa)
77
El ADN linear es más estable para la transfección; sin embargo, el plegado se capta mejor
V
78
El tiempo de incubación con el reactivo de transfección es breve: entre 24 y 48h
F
## Footnote
entre 1 y 6 h
79
La presencia de antibióticos puede disminuir la eficacia de transfección.
V
## Footnote
Modifican un poco la permeabilidad de la membrana por lo que restringen la eficacia de transfección.
80
Las células deben estar con un buen grado de confluencia para realizar la transfección: las
recomendaciones son que las células antes de ser transfectadas estén entre 50-80% de confluencia.
V
81
El proceso de transfección se suele realizar en un medio libre de suero, porque este hace que el liposoma resulte tóxico para las células
F
## Footnote
Se suelen hacer sin suero porque este dificulta la formación de los lipocomplejos.
El inconveniente es que la AUSENCIA de suero puede hacer al liposoma más tóxico.
82
El complejo puede interaccionar con el antibiótico disminuyendo la eficacia y aumentando la toxicidad.
V
83
Cada método de transfección tiene su propia eficiencia de transfección característica.
F
## Footnote
Un mismo método puede tener eficiencias distintas para distintos tipos celulares.
84
¿Por qué en la electroporación se ponen las células a 0ºC?
Para retrasar el cierre de los poros.
## Footnote
La fluidez de la membrana haría que se cerrasen enseguida; como a menor temperatura hay menos fluidez, esta estrategia permite retrasar el cierre de dichos poros.
85
La electroporación consiste en poner en contacto las células con el vector y someterlas durante unos instantes a un alto voltaje, lo que genera poros en la membrana qu epermiten la incorporación del vector
F
## Footnote
BAJO voltaje
86
La electroporación es un método de transfección ideal si partimos de una pequeña cantidad de células y estas crecen en suspensión.
F
## Footnote
Es mejor para células en suspensión (aunque se puede usar para células en monocapa si se desadhieren previamente)
Pero no es óptimo si disponemos de pocas células porque aproximadamente el 50% mueren en el choque eléctrico, lo que reduce significativamente la cantidad de células.
87
¿Qué método de transfección usarías para un cultivo de células vegetales?
La biolística, porque al tener pared celular estas células no realizan endocitosis y la electroporación no es efectiva sobre ellas.
88
Una vez realizada la transfección, el uso de antibióticos de selección nos permite asegurarnos de que llas células supervivientes han integrado el transgen.
F
## Footnote
Puede darse el caso de que en algún clon el transgen se haya desligado del vector y que por tanto haya sobrevivido gracias a haber integrado la resistencia a antibióticos pero sin el transgén de interés.
POr eso se testa la expresión del transgén.
89
Pon un par de ejemplos de aplicación de la técnica de transfección.
* Facilitar el estudio de la regulación de la expresión de un gen (región reguladora de la expresión del gen)
* Sobreexpresión de proteínas para el estudio de su función, o su producción a gran escala
* Silenciamiento de genes
* Terapia génica
* Estudio de la actividad de rutas de señalización.
* Genes reporteros
90
Quiero estudiar cómo funciona la regulación transcripcional de la albúmina, pero al tratarse de una proteína tan genérica resulta muy difícil de medir... ¿se te ocurre alguna estrategia que me pueda facilitar el estudio de la regulación de su expresión?
El uso de un gen reportero (codifica para una proteína fácil de detectar, de manera que puedo unir la región reguladora de la albúmina al gen de, por ejemplo, la luciferasa) y medir la expresión de esta en diferentes condiciones, lo que reflejará cómo afectan estas a la región promotora de la albúmina.
91
Las técnicas de transfección nos permiten sobreexpresar proteínas, tanto para estudiar su
función como producirla en gran escala.
V
92
Una posible aplicación de todas las técnicas de transfección el el silenciamiento génico mediante siRNAs
F
## Footnote
Los siRNAs solo se pueden introducir en las cñelulas mediante reactivos de transfección de base lipídica (lipofección)
93
siRNA hace referencia a un corto ARN de interferencia (ARN de doble cadena cuya diana es específicas para 19-25 nucleótidos, con 2-nt saliendo de cada extremo 3’).
V
94
El siRNA permite realizar un silenciamiento ya que evita la transcripción de un gen
F
## Footnote
evita la TRADUCCIÓN
95
Actualmente las técnicas de transfección no permiten silenciar genes de manera estable, únicamente realizan silenciamientos transitorios
F
## Footnote
El uso de plásmidos de shRNA permite realizar silenciamientos estables:
El plásmido llega al núcleo, donde se transcribe, dando un shRNA;
DICER reconoce y rompe la horquilla, generando un siRNA.
Es decir es una estrategia para que la célula sintetice sus propios siRNAs de manera sostenida en el tiempo.
96
Los Plásmidos de shRNA constan, en su Multicloning site, de 19-25 nt de la secuencia diana, separados de su secuencia complementaria por un bucle de 6 pb.
V
97
CRISPR/Cas9 es la técnica de transfección con mejor eficiencia en la actualidad.
F
## Footnote
Es una herramienta de edición génica, NO una transfección.
98
El sistema CRISPR/Cas9 consiste en una nucleasa inespecífica dirigida a una región conreta del DNA mediante una secuencia de RNA guía
V
99
# ```
```
La acción de la nucleasa CRISPR activa los mecanismos propios de la célula para reparar el ADN, que pueden resultar en la pérdida de la región cortada y/o en la introducción de una nueva secuencia en sustitución de ésta.
F
## Footnote
En el sistema CRISPR/Cas9, la nucleasa es Cas9
100
De manera breve, ejemplifica el potencial de CRISPR/Cas9 ¿qué posibilidades ofrece?
El potencial de esta técnica es muy grande, ya que:
- puede regular la expresión génica
- permite crear modelos de animales para estudiar enfermedades complejas
- aplicar una terapia génica muy dirigida (futuro), en especial aquellas que estén provocadas por la mutación de un solo gen.
101
Los fibroblastos son un tipo celular al que se recurre con frecuencia para la realización de cocultivos
V
## Footnote
Suelen servir de soporte para mejorar la viabilidad de cultivos celulares a los que les cuesta crecer, o hacerlo de forma relativamente normal, en cultivo.
102
El inconveniente de los cocultivos es que despuén no puedes estudiar los tipos celulares por separado
F
## Footnote
- Si es un cocultivo directo puedes usar el cell sorter
- O puedes realizar un cocultivo indirecto mediante placas transwell
103
Las placas transwell contienen una membrana para separar los distintos tipos celulares permitiendo la comunicación paracrina.
V
104
¿Cuáles son las limitaciones de los cultivos 3D?
- Hay un límite del tamaño del cultivo, ya que no dispone de un sistema vascular que permita el intercambio de gases y de nutrientes, por lo que un diámetro mayor a 250 µm (unas 5000 células) complica la difusión de éstos.
- La menor reproducibilidad respecto al cultivo en monocapa, ya que no hay cultivos 3D de referencia o estandarizados.
105
Los geles de colágeno suponen una matriz que funciona especialmente bien con células epiteliales, que penetran esta matriz y se organizan de forma parecida a la histológica.
V
106
Las sondas fluorescentes se visualizan mediante microscopía confocal o citometría de flujo
V
