T7 - Técnicas ácidos nucleicos Flashcards
(19 cards)
La aplicación de técnicas de Biología Molecular al análisis de genomas complejos depende de la capacidad de aislar fragmentos puros de ADN y ARN y, en el caso de los primeros, también de poder aislar moléculas de elevado peso molecular.
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Dado que los ácidos nucleicos se encuentran tanto en tejidos sólidos como en la sangre, se pueden purificar ácidos nucleicos partiendo de muestras sólidas o líquidas
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Para purificar ácidos nucleicos hay que partir de una disolución acuosa. La preparación de la disolución acuosa depende de la procedencia de la muestra
Si la sangre es un tejido, ¿por qué hay diferentes protocolos de purificación de ÁN para “tejidos” que para “sangre”?
Las muestras de tejido se recogen y se congelan en N líquido (si no es posible, también se usa hielo seco). A continuación, se procede a la digestión y lisis del tejido con reactivos adecuados (e.g. proteinasa K).
Así se obtienen ÁN en general.
La purificación de ADN de sangre es difícil porque la sangre es una mezcla compleja de células, proteínas, metabolitos, etc. Más del 99% de las células son eritrocitos, que no tienen núcleo (carecen de ADN). El ADN de la sangre debe aislarse de los leucocitos (0,3% del total de las células sanguíneas) y debe estar libre de contaminantes que interfieran en métodos posteriores (e.g. el grupo hemo provoca una fuerte inhibición de la Taq ADN polimerasa durante la PCR→ hacer muchos lavados).
No obstante, aunque es difícil obtener DNA de sangre, es más fácil tomar una muestra de sangre que no hacer biopsias.
La extracción con fenol:cloroformo es el protocolo de aislamiento de ARN más habitual.
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ADN
El fundamento de extracción fenol:cloroformo es la capacidad de los disolventes de desnaturalizar y precipitar ácidos nucleicos
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Capacidad de los disolventes de desnaturalizar y precipitar PROTEINAS sin afectar a los ácidos nucleicos en este sentido.
Explica el protocolo de extracción con fenol:cloroformo
Partiendo de la dilución de ÁN tras haber lisado etc. la muestra…
1. Se añaden a la muestra fenol y cloroformo a partes iguales.
2. Agitar 5-10’ y centrifugar: se separarán ADN y ARN en la fase acuosa y los restos de proteínas en la fase orgánica.
3. Recoger el ss a un nuevo éppendorf donde se añaden sales y etanol. Estos, tras enfriar y centrifucar provocan la precipitación de los ÁN.
4. Se descarta el ss y se realiza un lavado con etanol 80% (con mezcla y centrifugación).
5. Los ÁN vuleven a quedar en el pellet, por lo que se decanta el ss y se deja secar el pellet.
6. Se añade tampón (e.g. fosfato) para resuspender el pellet, y también ARNasas (porque el objetivo es purificar ADN)
7. Se congela a -20ºC
*no es ADN puro, porque la ARNasa es proteína, pero la cantidad es tan ínfima que no se considera. Aunque suelen ser proteínas con autoself-digestion, dejan contaminación, aunque sea de aa.
Tripure, Tri-Reagent y Trizol Son compuestos caotropicos, normalmente sales de isotiocianato y fenol
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Las técnicasde aislamiento y purificación de ARN son más sencillas que las de ADN.
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El aislamiento de ARN no difiere mucho del de ADN, aunque presenta un problema: la posible contaminación de las muestras con ribonucleasas, enzimas muy estables que por tanto pueden degradar el ARN.
Tras añadir a nuestra muestra TriZol, cloroformo y centrifugar… ¿qué componentes obtenemos y en qué fases se separan?
Obtenemos :
ARN en fase acuosa
ADN + prots en la interfase
Proteínas en la fase orgánica.
Tras la extracción y purificación de ARN es vital almacenalo a -20ºC
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Es muy lábil –> a -80ºC
En una extración y purificación de ARN obtenemos el ARN total… ¿qué ARN es mayoritario dentro de este?
ARN ribosómico
Los ácidos nucleicos abosrben luz UV a 260 nm
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Para evitar la interferencia de la absorción de UV por el plástico de las cubetas a 260 nm, se han desarrollado métodos de detección como Nanodrop o Bio Spec-Nano que usan cubetas de cuarzo.
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- Se pueden usar cubetas de cuarzo en vez de cubetas de plástico
- O se pueden usar métodos de detección que no requieren cubetas (estos son Nanodrop y Bio Spec-Nano
Para determinar la cantidad de oligonucleótidos en una muestra se multiplica la absorbancia a 260 por 40 para obtenner la concentración en mg/mL
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Se multiplica por 30 y se obtiene en ug/mL
¿Cómo podemos extrapolar la absorbancia de una muestra a concentración de los distintos ácidos nucleicos?
ADN: A260 x 50 µg/mL
ARN: A260 x 40 µg/mL
Oligonucleótido: A260 x 30 µg/mL
Si en una muestra de ácidos nucleicos purificados la ratio 260/230 es mayor de 1,5 quiere decir que la muestra está contaminada con sales, carbohidratos y fenoles
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MENOR QUE 1,5
Para considerar que la pureza de una dilución de ácidos nucleicos purificados es óptima, la ratio A260/280 ha de encontrarse entre…
1,8-2 en el caso del DNA
1,6-1,8 en el caso del RNA
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En ambos casos es óptima si se encuentra entre 1,8 y 2 para ambos ÁN;
si se encuentra ente 1,6 y 1,8 se considera “aceptable”
¿Qué significa una ratio 260/280 >2,1?
Si lo que hemos purificado es ADN: contaminación con ARN, ADN degradado
Si es ARN: ARN degradado → si hay contaminación con DNA no lo sabrás nunca (aunque si lo has hecho bien, no debería haber).
