TEMA 2 - Replicación en Eucariotas Flashcards
¿Cuáles son las semenjanzas entre la replicación eucariota y la procariota?
- Semiconservativa
- Bidireccional
- Semidiscontinua
- Está controlada
- El mecanismo general está conservado.
¿Cuáles son las diferencias entre la replicación eucariota y la procariota?
- Velocidad menor (en eucariotas que en procariotas)(60kb/min).
- Multiples orígenes de replicación (en cada ciclo se activan 30000-50000).
- Rondas no solapadas.
- Fragmentos de Okazaki más cortos.
- Control más complejo.
¿Están conservadas en la evolución las proteínas de replicación?
Sí. Cada una tiene su equivalente en eucariotas.
A
RF-C
B
PCNA
C
DNA pol epsilon
D
MCM2-7
E
RPA
F
DNA pol delta
G
DNA pol alfa/primasa (en eucariotas los primers se hacen de RNA y después DNA=de ahí el nombre).
¿Qué virus ha sido utilizado mucho para estudiar la replicación en eucariotas?
Virus SV40. Utiliza para su replicación todas las proteínas de la célula eucariota hospedadora menos la proteína iniciadora y la helicasa (large T antigen).
¿Cómo colaboran las tres polimerasas eucariotas en la replicación?
A
DNA pol alfa
B
DNA pol delta
C
DNA pol epsilon
¿De qué subunidades está compuesta la DNA pol alfa/primasa y cómo se relaciona a su función?
Compuesta por 4 subunidades:
- Una con actividad DNA polimerasa
- Dos pequeñas con actividad primasa (RNA pol).
- Una subunidad para el ensamblaje y regulación de la enzima.
No tiene actividad tres’-cinco’ exonucleasa (no corrige errores).
Sintetiza un primer formado por 10 bases de RNA y 20-30 bases de DNA (iDNA).
¿Por qué se llama el PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen?
Es un antígeno que se ha estudiado como marcador de la proliferación celular, ya que más PCNA=más replicación=mayor proliferación.
¿Qué caracteriza los orígenes de replicación en eucariotas superiores?
No hay una secuencia que caracterice los origenes de eucariotas superiores. Hay otras características que se han visto en orígenes de replicación (no en todos):
- NFRs (Nucleosome Free Regions).
- Hélices cuádruples (G4).
- Modificaciones de cromatina.
Estas dos últimas se cree que favorecen la formación de NFRs y/o reclutan factores implicados en la activación del origen.
¿De qué manera se activan los distintos origenes de replicación en eucariotas?
Se activan distintos orígenes de replicación a distinto tiempo de manera ordenada. Hay algunos que nunca se llegan a activar, a pesar de replicarse todo el ADN.
¿Qué tipos de orígenes de replicación hay?
Constitutivo: se activa siempre.
Inactivo/dormant: Nunca se activa. Se puede convertir en flexible en situaciones de mucho estrés.
Flexibles: Se usan o no usan de distinta manera en distintos tipos de células. También puede variar su actividad dependiendo de condiciones fisiológicas.
¿Qué determina que un origen de replicación vaya a ser usado o no en la siguiente ronda de replicación?
En la fase G1 todos los orígenes potenciales reclutan las proteinas preRC (pre Replication Complex). La selección de los origenes que serán usados en la próxima fase S ocurre durante la fase G1. Esto dependerá de condiciones fisiológicas y condiciones de crecimiento.
¿Qué es una unidad de replicación?
Secuencia en la que hay varios origenes de replicación, pero sólo se activa uno de ellos (interferencia negativa).
¿Qué es un cluster de replicación?
Conjunto de unidades de replicación en el que las unidades de replicación se activan a la vez (interferencia positiva).
¿Por qué se da el inicio de la replicación en dos pasos?
(selección y activación de orígenes de replicación)
Porque deben de existir controles para que la replicación solo se de en fase S, no haya solpamiento de rondas de replicación y se mantenga el patrón de activación de los orígenes.
¿Qué es una ARS?
Autonomous replication sequence. Se suele meter en plasmidos para que se puedan replicar en eucariotas.
¿Qué es el ORC?
Origin Recognition Complex (el equivalente a la DnaA en eucariotas).
Es un complejo de 6 proteinas (hexámero).
En ARS reconoce los elementos A y B1.
Al igual que DnaA, se une al origen e hidroliza ATP y es necesario para reclutar otras proteínas. Sin embargo, no participa en la apertura de la doble hélice.
¿Cómo se da el ensamblaje del complejo pre-replicativo?
Durante la fase G1:
- ORC reconoce el origen de replicación y se une a él.
- ORC recluta los cargadores de la helicasa CDC6 y CDT1.
- MCM9 también coopera con CDT1 para cargar la helicasa.
- Se carga la helicasa MCM2-7 en el dsDNA, pero sólo se activará en fase S.
¿Qué tres mecanismos usa la célula para evitar que se vuelva a iniciar la replicación?
- Proteína Geminin se une a CDT1 y la desactiva (ya no puede cargar la helicasa).
- Fosforilación (mediada por CdKs normalmente) de componentes del pre-RC (CDC6, CDT1, MCM, ORC1) para evitar la reactivación del origen.
- Vía ubiquitina-proteasoma degrada licensing factors (como los del complejo pre-RC) una vez se entra en la fase S.
¿Durante qué momento del ciclo celular se pueden establecer los pre-RC? ¿Cómo son los niveles de ciclinas en ese momento?
A
Complejo claspin-TIM-TIPIN.
Coordina el desenrollamiento con la síntesis de DNA.
B
DNA polimerasa epsilon.
Síntesis de la cadena de síntesis continua.
C
DNA polimerasa delta.
Síntesis de la cadena de síntesis discontinua.
D
endonucleasa FEN1+ligasa.
Unión de fragmentos de Okazaki.
E
DNA polimerasa alfa.
Responsable de síntesis de primers.
F
Complejo CMG (CDC45, MCM2-7 y GINS).
Desenrollamiento de dsDNA.
¿Cómo se da la unión de los fragmentos de Okazaki?
3 vías:
1. Vía RNasa H2-Exo1:
Primers RNA-DNA son directamente hidrolizados por RNasa H2 (RNA) y Exo1. Unión de los fragmentos por ligasa I.
2. Vía long flap:
DNA pol delta sintetiza DNA y desplaza los primers RNA-DNA, creando ‘long flaps’ recubiertos por RPA. Dna2 hidroliza la mayor parte del flap, dejando uno de 5-7nt. Fen1 digiere el lo que queda (short flap). Unión de los fragmentos por ligasa I.
3. Vía short flap:
DNA pol delta sintetiza DNA y desplaza los primers RNA-DNA, a la misma vez Fen1 va quitando el ‘short flap’ de poco en poco, hasta que se digiere todo el primer.
¿Cómo se comparan las proteínas de replicación en Archaea con las de Bacteria o Eucariotas?
Suelen contener las mismas proteínas que las eucariotas (normalmente les falta alguna, o tienen una extra sólo encontrada en Archaea).
¿Que problema hay con la replicación de los extremos de los DNA lineales?
Debido a la síntesis discontinua de la lagging strand, al final del cromosoma, llega un momento en el que la primasa no tiene suficiente espacio para sintetizar un primer. Esto resulta en una replicación incompleta y un acortamiento por el extremo 3’ de la nueva hebra sintetizada a partir de la lagging strand.
¿Qué se ha visto que se usa en algunos DNA lineales como primer?
¿Cómo es la secuencia en el DNA telomérico?
Secuencias cortas repetidas en tandem (ricas en TG). Con fórmula general: 5’-(T/A)nGm-3’
n=1-4. m>1.
Tienen extremos 3’ protuberantes de 14-16 bases de ssDNA (esta hebra es la rica en TG.
¿Cómo es la estructura secundaria del telómero?
Se crea un bucle de DNA (t-loop) de 5-10kb en mamíferos.
El extremo 3’ protuberante de ssDNA hibrida con la hebra complementaria, desplazando una región upstream de su misma hebra.
La formación del t-loop está catalizada por la proteína TRF2.
¿Qué es el complejo shelterin?
Un complejo de seis proteínas que se une al telómero. Estas protegen el telómero, regulan su longitud y reclutan a la telomerasa.
TRF1=replicación del telómero, TRF2, Rap1, TIN2, TPP1=recluta telomerasa, POT1=inhibe telomerasa.
¿Cómo es la estructura de la telomerasa?
Tiene dos subunidades principales:
TERT: Telomerase reverse transcriptase (ya que es una DNA polimerasa que usa molde de RNA).
TERC: Telomerase RNA component (que lleva el RNA molde).
Además de esto, usa varias proteínas accesorias.
¿Cómo alarga la telomerasa los telómeros?
El RNA hibrida con la protuberancia 3’ de la hebra parental del lagging strand y alarga este extremo 3’.
De esta manera, hay hueco para que se una un primer y que la DNA polimerasa sintetize otro fragmento de okazaki en la lagging strand, provocando el alargamiento del telómero.
¿En qué células está activa la telomerasa?
- Células germinales.
- Células madre.
- Casi todas las células tumorales.
¿Qué ocurre en células cancerígenas cuando se llega a una longitud de telómeros crítica?
La pérdida de las vías represoras de tumores RB y p53 impide que se detenga el ciclo celular con señalización de ATR y ATM.
Cuando muchos telómeros se acortan tanto que pierden su función empieza a haber fusiones de cromosomas por sus extremos (cromosomas dicéntricos) y gran inestabilidad genética.
Eventualmente, una reactivación de la telomerasa reestablece la longitud de los telómeros y aporta una mayor estabilidad genómica.
¿Cuando se ensamblan los nucleosomas?
Inmediatamente después de la replicación.
¿Cuál es la composición de un nucleosoma?
Tienen un tetrámero H3.H4 y dos dímeros H2A.H2B. (+DNA enrollado alrededor).
¿Cómo se dsitribuyen las histonas nuevas y viejas en el ensamblaje de nucleosomas después de la replicación?
Tetrámero H3.H4 viejo se une a una de las moléculas de nueva síntesis al azar.
El tetrámero H3.H4 nuevo se une a la otra molécula.
Los dímeros H2A.H2B viejos se disocian y compiten con los H2A.H2B nuevos por asociación con el tetrámero H3.H4.
Por esta regla, lo más probable es que en una de las moléculas hijas de DNA, 1 de cada dos histonas tengas tetrámero H3.H4 antiguo/nuevo.
¿Cómo se mantienen las modificaciones de histonas en los nuevos nucleosomas?
La mezcla de histonas antiguas y nuevas informan a las enzimas que replican las mismas marcas epigenéticas que hay en las parentales en las nuevas. (las modificaciones en las antiguas reclutan e informan a las proteínas de replicar la modificación en otras histonas).
¿Cómo actúan las chaperonas de histonas en el ensamblaje de histonas?
CAF-I se une al PCNA y recluta tetrámeros H3.H4 nuevos.
NAP-I participa en el ensamblaje de los dímeros H2A.H2B
