TP2 - CITOMETRIA DE FLUXO Flashcards
(19 cards)
CITOMETRIA DE FLUXO
- estudo de cels individualizadas
- cels conduzidas num fluxo, uma a uma, em frente a fonte de energia
- analise de particulas e medicao de parametros atraves do citometro
- permite analisar mistura complexo de celulas com marcadores (anticorpos conjugados com fluorocromos que quando excitados emitem luz)
desvios
frontal (forward scatter) FS
- tamanho da celula
lateral (side scatter) SSC
- complexidade e granularidade
fotomultiplicadores
- info sobre comp onda da luz emitida p fluorocromo
componentes essenciais p desenv da citometria de fluxo
CAPACIDADE FLUíDICA
- passar cels uma a uma no fluxo (linha indiana e nao dupletos)
- passar fluxo a alta velocidade
OTICA
- capacidade de analisar dif comp de onda
- desenv de fluorocromos que emitam fluorescencia de forma estavel, brilho e intensidade forte
DESENVOLVIMENTO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
- p tudo oq queremos estudar
definicao
- tecnica biofisica
- qualitativa (esta ou nao na amostra)
- quantitativa (quanto do alvo está na amostra)
- separacao de particulas numa suspensao monodispersa num meio liquido
caracteristicas
automatizacao
- quer a preparacao quer a analise dos dados
analises multiparametricas
- quanti e quali, grande n de particulas individualizadas
capacidade separativa
- em funcao das caract estabelecidas p analise
- permite obter populacoes puras e viaveis
vantagens
- rapidez
- estudoquanti e quali
- alta sensibilidade (cel c caracteristicas raras pode ser detetada pois elevado numero de celulas sao analisadas quanti e quali)
- multiparametrica (5 a 50 parametros ao mm tempo)
- separacao de subpopulacoes das amostras
- aumento representatividade amostras estudadas e precisao de resultados
- menor tempo gasto
limitacoes
cels tem de estar em suspensao
- n podemos estudar tecidos e sim as cels que estao nos tecidos
- sangue nem sempre representa o que acontece a nivel local
- situacoes que e necessario estudar dupletos
necessidade de controlos
- precisamos de cut off, ou seja, a partir de que intensidade consideramos algo positivo ou negativo
medida da densidade de recetores por citometria de fluxo
- proporcao direta entre intensidade de sinal e antigenios que estamos a esudar
- nivel 1 ( sinal p quando nao ha lfuorescencia) 2 ( maior intensidade. alguns antigenios a superf) 3 ( mais int, mais densidade de antigenios a superf)
- permite medir densiade de recetores a super da celula
citometria de fluxo multiparametrica
- possivel analisar varios parametros num unico tudo em simultaneo
- analise simultanea e de diferentes fluorocromos faz com que p alguns flurocormos haja intensidades de fluoresencia coincidentes, logo aparelho tem de ser compensado e retirar a nterferecia de um quando estudamos o outro
informacao da citometria
- n celulas com expressao de um antigenio alvo (quanti abs e relativa)
- distribuicao de celulas de acordo com densidade de antigenios ( atraves da intensidade de fluoresencia)
- tamanho celular
- (…pg 41)
citometria em imuno
- ident e separacao de cels sanguineas
- diferencia subpopulacoes de linf T
- contagem subpopulacoes t dc4 e cd8
(…pg42)
separacao de cels sanguineas sem fluorocromos
(dos leucocitos)
- atravas dispersao frontal (tamanho) e lateral (complexidade e granulosidade)
linfocitos
- pequenas
- mononucleares e pequena complexidade
monocitos
- tamanho e complexidade ligeriamente maiores (mas pequenos na mesma e continua a ser mononuclear)
granulocitos
- mais tamanho e complexidade
produção de anticorpos monoclonais
- cada tipo de cel B so produz um tipo de anticorpo com especificidade definida
- problema: cels B so produzem um tipo de anticorpo e nao se dividem indefinidamente
- solucao: utilizacao de mieloma (cels neoplasticas)
-
procedimento:
1) imunizar cels de animal (pe, do baco de rato) com antigenio de interesse
2) producao (pelas cels B) de varios anticorpos p aquele antigenio
3) fusao cels B com cels neoplasticas (=hibridoma)
4) processo de selecao das cels de interesse com base nas caract geneticas
5) cultivo da cel de interesse, obtendo muitos hibridomas
6) purificar anticorpos - monoclonais pq sao obtidos a partir de um unico tipo de celula que se dividiu de forma clonal
utilidade cels monoclonais
in vitro
- DIAGNOSTICO (p identificacao de marcadores fenotipicos da superf das celulas)
a) caracterização de cels
b) avaliacao da atividade funcional (recetores de ativacao…)
IN VIVO
- diagnostico
- terapeutica
- (a surgir) teranostica ( fusao diagnostico e terapeutica, conjugando anticorpos com todo o tipo de drogas)
diferenciação cels hematopoiéticas
(marcadores no ipad)
- citometria imp na caracterizacao da diferenciacao
- conhecimento de recetores imp p identificar algumas celulas
- anticorpos conjugados com fluorocromos conseguimos analisar presenca de antigneios
- na citometria usa se combinacoes de fluorocromos p possibilitar analisar mais anticorpos com menos fluorocromos
expressão de moléculas de superfície mais comuns nas cels sanguíneas
- recetores muito frequentes e outros menos frequentes
- pe, observar distribuicao cd4 e cd8 pode dar nos pistas de algo nao estar bem
citometria de fluxo e sida
1) infecao valores absolutos de cd4 sup a 1000 p microlitro
2) queda
3) seroconversao aumento das cd4
4) avanco fase assintomatica com declinio das cd4
5) fase sintomatica
6) sida (menos de menos de 200)
- citometria para, pe, atraves de conjugacao cd3 e cd4, ver freq relativa de cd4 e de seguida saber n exato cels cd4
citometria de fluxo e pesquisa do HLA-B27
- HLA associado a espondiloartropatias (95% doentes tem, logo associacao forte p diagnostico)
1) adiconar anticorpo HLB com fluorocromo numa amostra de sangue
2) analisar intensidade de fluorescencia
3) densidade do recetor da nos presenca de amostra positiva ou negativa (atraves de cut off previamente estabelecido)
F.A.C.S. (Fluorescence-Activated Cell Sorter)
- cell sortes sao equipamentos de citometria
- quando cels saem do capilar sao transformadas em gotas
- uma gota tem uma celula e sao carregadas eletricamente
- gotas passam por placas defletoras e sao separadas consoante carga
(desvio comandado pelo operador) (gota positiva para a placa negativa)
