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Complément virologie > Vecteurs > Flashcards

Vecteurs Flashcards

1
Q

Décrire expression transitoire

A

TG non intégré

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Q

Décrire expression permanente

A

TG intégré, modification est transféré dans les cellules filles par division cellulaire

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3
Q

Décrire transformation

A

introduction de matériel génétique à l’intérieur d’une bactérie

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4
Q

Décrire transfection

A

introduction, sans aide de vecteur viral, de matériel génétique dans une cellule eucaryote

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5
Q

Comment effectuer la transfection (3 façons)

A
  1. Phosphate de calcium (Ca2+ masque polarité négative de l’ADN)
  2. liposomes (fusionne avec membrane cellulaire)
  3. électroporation (augmente perméabilité de la membrane cellulaire)
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6
Q

Décrire transduction

A

introduction matériel génétique dans une cellule (euk ou prok) à l’aide d’un VIRUS ou VECTEUR VIRAL

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7
Q

Décrire vecteur réplicatif (3 points)

A

Se réplique de manière autonome
Réalisation de TOUT le cycle de vie du virus se produit a/n des cellules cibles
Il y a production nouvelles particules virales qui vont transduire les cellules environnantes

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8
Q

Décrire vecteurs oncolytiques

A

Vecteur se répliquant et éliminant spécifiquement des cellules cancéreuses

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9
Q

Décrire vecteur non réplicatif (ou défectif)

A

gènes essentiels à la réplication sont retirés (rend les virus incompétents à la réplication)
Nécessite plasmide d’encapsidation (exprime gènes viraux essentiels retirés qui permettaient de produire particules virales du vecteur)
—- ne produisent aucune particule virale a/n des cellules cibles

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10
Q

Séquences essentielles aux vecteurs

A
  1. TG
  2. Promoteur
  3. Psy (encapsidation du vecteur)
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11
Q

Séquence événements vecteurs non réplicatifs

A
  1. Transfection dans cellules d’encapsidations (nécessite plasmide encapsidation)
  2. Encapsidation
  3. Transduction
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12
Q

2 types de vecteurs rétroviraux

A
  1. Vecteurs rétroviraux (gammarétrovirus)
  2. Vecteur lentiviraux (lentivirus)
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13
Q

Type de génome de vecteur rétroviral simple

A

ARN sb +

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14
Q

Exemple de virus gammarétrovirus

A

Moloney Murine Leukemia virus

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15
Q

Structure de gammarétrovirus

A

-5’LTR + 3’LTR
-PSY
-GAG (matrice, capside, nucléocapside)
-POL (protéase, RT, intégrase)
-ENV (glycoprotéine de l’enveloppe)

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16
Q

Exemple rétrovirus complexes

A

HIV-1

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17
Q

Structure lentivirus

A

LTR (3’ et 5’), GAG, POL
+ Protéines de régulation (Tat, Rev)
-Tat (transactivation de transcription des ARNs viraux)
-Rev (exportation ARN non épissés vers cytoplasme)
+ Protéines accessoires (Nef, VPr, Vpu, Vif): optimisation réplication virale via modulation fine de L’intéraction virus/cellules hôtes et évasion de la réponse immunitaire

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18
Q

résumé cycle réplication rétrovirus (HIV)

A
  1. Fusion
  2. décapsidation
  3. Transcription inverse
  4. intégration (intégrase (pol))
  5. transcription (Tat)
  6. export hors noyau (Rev)
  7. Traduction
  8. assemblage
  9. bourgeonnement
  10. maturation (protéase)
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19
Q

Construction vecteurs rétroviraux

A

NON RÉPLICATIFS (pathogènes): enlève gag pol et env (Remplace pour TG)
On garde séq PSY + LTR
*peut répliquer seulement dans cellules d’encapsidation
*gag pol et env doivent être exprimés sur plasmides différents pour éviter recombination
**évite sites de recombinaison possibles

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20
Q

Taille insert vecteur rétroviral

A

8kb

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21
Q

Vecteur rétroviral peut infecter quel type de cellule

A

cellules qui se divisent

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22
Q

Vecteur lentiviraux sont dérivés de quel virus

A

VIH1

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23
Q

Décrire vecteur lentiviral 1st gen

A

3 plasmides
1. packaging plasmid: promoteur CMV, gag pol et gènes accessoires
2. env: promoteur CMV + VSV-G
3. vecteur: 5’LTR, psy, RRE (Rev response element - export noyau vers cytoplasme), TG sous expression du promoteur CMV et 3’LTR

24
Q

Décrire vecteur lentiviral 2nd gen

A

comme vecteur 1st gen, mais pas de gènes accessoires

25
Q

Décrire vecteur lentiviral 3rd gen

A

4 plasmides :
1. Packaging (pro:CMV, gag, pol, RRE)
2. env: (pro:CMV, VSV-G)
3. Rev: (pro:CMV, Rev)
4. Vecteur: (pro:CMV, 5’LTR sans U3, psy et RRE, pro:CMV-TG, 3’LTR avec U3 muté)
différence avec 2nd gen: Rev sur un autre plasmide, LTR mutés, Tat enlevé

26
Q

Vecteur SIN?

A

Self-inactivating vecteur, inhibe l’activité des LTR
promoteur CMV en 5’ au lieu du U3; en 3’ U3 est muté
ADN intégré: 2 U3 mutés (pas de promoteur actif) -> permet de ne pas activer d’oncogènes à proximité

27
Q

Lentivirus en vecteur utilisé comme vaccin?

A

non

28
Q

Taille insert vecteur lentiviral?

A

10kb

29
Q

application vecteurs lentiviraux/rétroviraux

A

-Expression permanente protéines dans lignées cellulaires
- Expression inhibée d’une prot via utilisation vecteur exprimant ARN interférence
- Étudier protéines: surexpression permanente et suppression permanente
- sélection clones cellulaires en criblage (expression d’un gène de sélection)

30
Q

Vecteurs adénoviraux les + utilisés

A

Ad2 et Ad5

31
Q

Génome adénovirus

A

ADN db linéaire

32
Q

Transcription des adénos?

A

régions précoces + tardives

33
Q

Structure adénos

A

non enveloppé, prot fibre impliquée dans attachement

34
Q

Récepteur adénos?

A

CAR (Coxsackie + adénovirus réceptor)

35
Q

Décrire phase précoce cycle réplication adénos

A

Gènes précoces: E1A, E1B, E2, E3, E4: modulent expression gènes de l’hôte (facilite réplication ADNv + synthèse prot. tardives)
*E1A stimule transcription des autres gènes précoces, active le cycle cellulaire

36
Q

Décrire phase tardive réplication adénos

A

Commence avec réplication ADN
Transcrits tardifs (L1-L5) codent pour protéines structurelles nécessaire à assemblage, libération et lyse cellule hôte
Assemblage dans le noyau
Lyse + relâche 2-6j postinfection

37
Q

Décrire vecteur adéno 1st gen

A

délétion de E1 pour ajouter TG -> non réplicatif
Produite dans cellules exprimant E1
Enlève aussi E3 (pas effet en culture) pour augmenter taille de l’insert
Insert de 8kb (encapside max 105% de son génome)
*même si E1 enlevé, facteurs cellulaires semblables à E1 peut permettre expression gènes viraux -> toxicité + réponse immune (mort cellules transduites)

38
Q

Décrire vecteur adéno 2nd gen

A

délétion de E2 et E4 (essentiel réplication virale)
insert +- 14kb
Lignée encapsidation doit exprimet E1, E2, E4
*risque diminué réponse immune, de recombinaison avec virus sauvage ou RH

39
Q

vecteur adéno 3rd gen?

A

Délétion tous les gènes sauf ITR et PSY
Insert max 36kb (min 75% so insert DNA stuffer)
besoin d’un virus ou plasmide helper (helper contient pas la région PSY)

40
Q

Vecteur adénoviral oncolytique?

A

Délétion de E1B (lie et inactive p53 qui active normalement le cycle cellulaire) et puisque inactivation de p53 nécessaire à réplication virus; virus tropisme cellules tumorales p53-

41
Q

Désavantage utiliser vecteur adéno?

A

séroprévalence élevée dans population, neutralisation avant infection…

42
Q

Structure adéno associated virus

A

non enveloppé, chq sérotype a une capside particularités uniques, capside icosaédrique

43
Q

Génome AAV

A

ADN sb linéaire
contient ITR aux extrémité de chq brin
4 prot de réplication (Rep…)
3 prot de capside (VP…)
*code pas pour polymérase virale
*Incapable de réplication
*besoin d’un virus helper comme Adéno ou Herpes

44
Q

Vecteur AAV

A

-Délétion de Rep + cap : insert 5kb
-Rep + cap dans un plasmide d’encapsidation avec gènes adénos (E1, E2, E4, VA)
- AAV autocomplémentaire: insert moitié taille puisque 2 sections complémentaires. Augmente vitesse de transfection puisque pas besoin de synthèse du 2e brin

45
Q

Avantages Vecteur AAV

A
  • peu pathogène
  • large tropisme, selon sérotype
  • peut inf. cellules se divisant ou non
  • bon niveau expression pendant années même si aucune intégration (vecteur extrachromosomique)
    -produits en grande qté
46
Q

Désavantages vecteurs AAV

A

Taille insert : 5kb
Expression TG lente (nécessite synthèse 2e brin)

47
Q

ex rhabdovirus

A

VSV

48
Q

Génome Rhabdovirus

A

ARNsb-
Code 5 protéines (LP = 2 s-u)
- L (Large): ARNpol dép ARN
- P (Phosphoprotine): ARNpol dép ARN
- G: glycoprotéine enveloppe
- N: Nucléoprotéine
- M: Matrice (perturbe rép. immune)
*séq leader ET terminale: complémentaire, signal PSY, promoteur

49
Q

Récepteur VSV

A

Low density lipid receptor
entrée clathrine dép

50
Q

Réplication rhabdovirus

A

dans le cytoplasme

51
Q

Fonction de la protéine M

A

Inhibition de l’expression de gènes cellulaires
empêche export des ARNm
Bloque synthèse IFN

52
Q

Pourquoi VSV oncolytique intéressant

A

Se réplique de manière sélective dans les cellules qui ont défauts dans la voie IFN

53
Q

Applications vecteur VSV

A

-surexpression protéines
- virus oncolytique
- vaccin réplicatif

54
Q

Structure poxvirus

A

enveloppé, ADNsb, environ 100 gènes

55
Q

3 souches étudiées poxvirus vecteurs

A

NON RÉPLICATIVES
- MVA
-ALVAC
-NYVAC

56
Q

cycle réplication poxvirus

A

-Entrée par endocytose
- relache capside dans cytoplasme
- synthèse séquentielle transcrits précoces, intermédiaires et tardifs
- code sa propre ARNpol dép ADN
- Réplication cytoplasmique
- encapdisation ADN, acquisition des membranes dans TGN
-fusion pour sortir

57
Q

génération de VECTEUR poxvirus

A
  1. vecteur insertion: TK gène (site de restrictions, ORI + gène rapporteur
    + plasmide contenant TG + gène rapporteur
  2. clivage du vecteur insertion avec enzyme de restriction + ligation -> gène TK non fonctionnel
    –> création vecteur recombinant
  3. Infection avec WT + transfection -> le gène TK-va faire RH avec le gène TK+ du WT, sélection des virus TK- par BrdU (TK phosphoryle BrdU qui est incorporé dans génome viral et létal)

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