VL 13: Genregulation I: Transkriptionsregulation Flashcards
(34 cards)
1
Q
Regulation der Genaktivität bei Eukaryoten
A
- Zeiträume
- Kurzfristig: Reaktion auf veränderte Bedingungen
- Langfristig: Zelldifferenzierung
- positiv, aktivierend
- Negativ, reprimierend
- An unterschiedlichsten Teilschritten der Genexpression
2
Q
Teilschritte der Genexpression
A
- Regulation kann auf allen Etappen vom Gen bis zum Protein erfolgen
- RNA Regulation wegen der höheren Halbwerrtszeit in Eukaryoten im Vergleich zu Prokaryoten wichtiger
- Meistens auf Ebene Transkription
3
Q
Was ist Regulation
A
- Regulation von Was?
- DNA? mRNA? Protein?
- Biologisch relevant ist aktives Protein
- Was ist der ratenlimitierende Schritt für Produktion des untersuchten Moleküls?
- Welcher Schritt
- Regulation kann auf Ebene der DNA Menge geschehen,
- Obwohl wir denken, dass DNA unveränderlich ist
- RNA-Regulation wegen der höheren Halbwertszeit in Eukaryoten im Vergleich zu Prokaryoten wichtiger
4
Q
John Gurdon Experiment, erste Klone
A
- Zwei Froscharten
- Frog A
- Ei, zerstoert Kern → intaktes Ei ohne genetische Information
- Frog B
- Kernisolierung aus differenzierter Zelle
- Frog A
- isolierter Kern von Frog B wird in kernlose Eizelle von Frog A implantiert
- neuer Frosch → Klon von Frosch B
- alle Zellen in einem Organismus enthalten die gleiche Anzahl von Genen
5
Q
Regulation der Gendosis
A
- In einigen Fällen werden bei der Differenzierung von Zellen und Geweben Gene entfernt, die nicht benötigt werden, oder amplifiziert, wenn viel Genprodukt gebraucht wird
- Zellen, die eine vervielfachung der rDNA erreichen
- in Eizellen werden gewaltige Mengen an rDNA produziert
- Beispiel: Zellkern, Froschoozyte
- Gene für rRNA werden durch Rolling-Circle-Replikaiton amplifiziert und bilden Extranukleoli(viele Nukleoli) – ca. 1000-fache Vermehrung der rRNA Gene → viele Ribosomen
- Beispiel: Oozyte des Gelbrandkäfers
- Amplifizierter DNA-Ring mit fünf Transkriptionseinheiten für rRNA
- DNA Menge ist ratenlimitierend
- Besonderheit Ciliata: amplifizieren selektiv ihr Genom (im Macronukleus)
6
Q
Ciliata Regulation Gendosis
A
- Amplifizieren selektiv ihr Genom (im Macronukleus)
-
Micronukleus
- Kern fuer Sexualitaet verantwortlich
- werden waehrend Fusion v zwei Ciliaten fusioniert, Rekombinationsprozesse → Verteilung der Chromosomen auf Tochterzellen
- Chromosomen chaotisch aufgebaut
-
Macronukleus
- Exekutionsform der DNA
- heterochromatisch, wird nicht transkribiert
- Gene werden aus dem Nukleus nach Bedarf amplifiziert
- geordneter
- Amplifizierte Kern (1000fach)
- Größer
- mRNA
7
Q
Positive und negative Regulation der Transkription durch Proteinfaktoren
A
- Gene sind in unterschiedlichen Zellen unterschiedlich transkriptionsaktiv
- Z.B. Leber-cDNA-Proben in Nieren- und Gehirn-RNA nicht aktiv (in Leber-RNA schon)
- Andere cDNA Proben (Aktin, tRNA, etc.) in allen drei aktiv
8
Q
Positive Kontrolle: Galaktoseabbau in Hefe, Gal4 als Aktivator
A
- Wenn Glucose vorhanden ist, wenn die obigen Gene nicht produziert à Gal4 inaktiv
- Mel1: Galactosidase: Spaltet
- Gal2: bring Galactose in Zelle rein, Permease, Transporter
- Gal1: Kinase: macht Galactose reaktiv
- Gal 7: Uridyltransferase:
- Gal10: Epimerase:
- Galactose à Glucose
9
Q
Gal 4
A
- reguliert Gal1, Gal7 und Gal10
- Liegen nebeneinander auf Chromosom II
- Von verschiedenen Promotoren abhängig
- Gal 4 bedient alle Promotoren
- Gal 4 Aktivierung erfolgt über wweitere stromaufwärts gelegene Proteine
- Gal 80: Repressor Gal4
- Gal 3: Repressor des Repressors
- Galaktose: Aktivator Gal 3
10
Q
Gal 4 Struktur
A
-
Dimer
- 2 Gal4 Proteine
- DNA-bindene Domäne
- aktivierende Domäne (aktiviert DNA-Polymerase)
- beide Domänen können getrennt werden und trotzdem aktiv sein
- Gal4 bindet als Dimer an die major groove der DNA an gegenüberliegenden Seiten (typisch für TFs)
- Zink-Finger-Protein
- Zn2+-Ion
- Bildet Komplex mit 2 Cys und 2 His
- Gal4 hat mehrere Zinkfinger
11
Q
**Gal 4 Bindestelle und Kofaktoren
A
12
Q
Transkriptionsfaktoren
A
-
2 Domänen idr
- DNA-binde-Domäne
- Aktivierungsdomäne
- Bilden Dimere aus
- Homodimere/Heterodimere
- Die Dimerisierung erhöht die Anzahl von DNA-Zielen und Aktivierungsmodi
- 2600 TFs im menschl. Genom
- 1/10 Kodierungskapazität!
- diese Regulationsart sehr wichtig!
13
Q
TF Bindung an DNA
A
- Passen zumeist in die major groove der Doppelhelix
- 33 Angröm/ 11 bp zwischen den Zentren der DNA-Bindestellen
- TFs binden an anderen Strängen
14
Q
Typen von DNA-bindenden Domänen
A
-
Helix-turn-Helix (dominierende Familie in Bakterien)
- Homeodomain
- Zinkfinger – dutzende Subtypen
- Leucin-zipper/basischer Zipper (bZip)
- Basische helix-loop-helix
15
Q
Leucin Zipper
A
- TF: AP1 → Regulation der Produktion von Wachstumfaktoren (Cytokine, TGFbeta)
- Heterodimer Untereinheiten
- Jun
- Fos
- Teil der langen Helices reichen in DNA hinein
- Andere Teil verkleben über Leucine
*
16
Q
Helix-Loop-Helix
A
- MyoD → Regulation der Produktion von … wichtiger Faktor in der Entwicklung von Muskelzellen aus Muskelvorläufern
- Loop unskrukturierter Aminosäuren
- Lange Helix für Dimerisierung
- Helix die Kontakt aufnimmt
17
Q
Zink Finger TF
A
- Koordinieren Zink
- können mehrere Zinkfinger haben
- Z.B. Cys-His oder Cys-Cys
- Können sowohl DNA als auch RNA binden
- Können DNA auf unterschiedlichste Weise binden:
- Eine DNA-Bindungsmöglichkeiten
- Z.B. Finger machen alpha-helikalle Struktur, welche in major groove der DNA-Helix eingreift
- Multiple Finger können kooperativ Nukleinsäuren binden
18
Q
Aktivierung von Transkriptionsfaktoren
A
- In Prokaryoten: allosterische Moleküle verändern DNA-Bindung (e.g. TRP-Repressor)
- In Eukaryoten
- Aktivatordomäne wird entmaskiert (Bindeprotein der AD wird durch Ligand/Phosphorylierung entfernt
- TF wird durch Lokalisation aus Cytosol in den Zellkern aktiviert
19
Q
Multiple Aktivatoren sind die Regel in der eukaryotischen Zelle
A
- Damit nicht zufällig transkribiert wird
- Genom so komplex
20
Q
Wie ist die Repression anders als bei Prokaryoten
A
- In eukaryoten Repressoren verhindedrn nie die Bindung der Pol
- In Prokaryoten wird verhindert, dass RNA-Pol bindet
21
Q
Hefe-Ein-Hyrbid System und Gal4
A
- Domänen können voneinander getrennt werden (modularer Aufbau)
- Auch ohne aktivoter domäne kann binde domäne DNA binden, aber keine Transkripsiton
- Fusion von Gal4-Aktivator und anderer DNA-Bindedomänen à Transkription funktioniert
- Aktivator- und DNA-Bindedomäne lassen sich separieren
Hefe-Ein-Hybridsystem
- Ausgang: DNA-Sequenz (bait element)
- „fängt“ Protein auf durch Fusionierung mit Aktivator-Domäne
- Rekrutierung Polymerase
- System zur Determinieren von Interaktionen zwischen Proteinen und DNA-Sequenzen
- Ausgang: DNA Sequenz (bait), die mich interessiert, ich möchte die Proteine fangen die sich an der DNA-Sequenz binden
- Man bestimmt welche Proteine, sich an spezifische DNA-Sequenzen binden
- Bait: DNA-Sequenz
- Prey: Protein
- Reportergene: Gene, die expliziert werden, um die DNA-Protein Interaktion sichtbar zu machen, zB. auxotrophe Marker (His) oder chlormetrische Marker (lacZ)
- Fusionieren der Bait-Elemente vor/upstream von einem kombinierten Selektionsmarkerreportergenkonstrukt
- lacZ → blaue Hefezellen
- His Gen: His-defiziente Hefezellen können His herstellen (auxotroph)
- Fusionieren des Preys (also Protein of interest) mit AktivatorDomäne eines Transkriptionsfaktors
- oder eine ganze Bank an Proteinen + AD
- Wenn bait (DNA-Seq) und prey (Protein mit anhängenden AD) interagieren, wird Reportergen exprimiert
- His wird exprimiert in Kolonie
22
Q
Hefe Zwei Hybrid System
A
- Identifikation von Protein-Protein-Interaktionen
- Separation der Aktivator- und DNA-Bindedomäne eines TFs (z.B. Gal4)
- Hybridisierung DBD mit einem bait/Köder (BaitProtein) (in diesem Fall RNA-Bindeprotein) durch Translationsfusion
- AD hybridisiert mit vielen verschiedenen Proteinen (Beuteproteinen), von denen wir wissen möchten ob sie mit Köder interagieren, vlt mit ganzem Proteom (von Pflanzengenom/Mausgenom/Krokodil/etc.)
- Ziel: Herausfinden welches Protein mit bait interagiert
- Wenn bait und Protein miteinander interagieren wird vollständiges TF hergestellt
- Transkription der Reportergene findet statt
23
Q
Probleme beim Hefe-Zwei-Hybrid-Zyklus
A
- Hefe hat andere physiologische Bedingung
- Proteine nicht unbedingt gut bzw. schlecht exprimiert
- Viele falsch-negative/falsch-positive
24
Q
Repression der Transkription - Typen
A
- Konkurrenz von Aktivator und Repressor um Bindestelle (a)
- Repressor bindet (und inaktiviert so) Aktivator = Inhibition (b)
- Repressor inaktiviert generellen Transkriptionsfaktor (c)
- Dicht-gepacktes Chromatin
- Direkte Bindung des Repressors mit Operator-Sequenz, die mit Sigmafaktor und RNA-Polymerase bindet à direkte Kompetition (aber selten in eukaryoten))
25
Beispiel für negative Kontrolle: Galaktoseabbau in Hefe, Mig 1 alss Repressor
* Mig1 verhindert, dass Gal4 exprimiert wird und andere Gene
* Aktiv, wenn viel Glucose vorhanden (da Galactoseabbau dann nicht notweendig ist)
* Glucose schaltet Kinase aus bei hoher Konzentration
* Mig1 liegt unphosphoryliert vor
* Mig 1 kann von Cytoplasma ins Kern wandern
* Repression
* Mig1 wird über eine Glucose-abhängige Kinase phosphoryliert und damit deaktiviert
* Doppelte Repression
26
Wie wird Spezifität der Transkription erreicht?
* Transkriptionsfaktor wird nur dort synthetisiert /Gewebe, Zelle), wo benötigt
* TFs in der Ontoogenese
* **TF immer da**, **muss** aber durch Modifikation **aktiviert** werden
* Hear schock Faktoren – phosphoryliert
* Beta-catenin/armadillo – dephosphoryliert
* TF wird **durch Lokalisation inaktiviiert** (zur Membran)
* Sterol response Faktoren
* TF wird v**on Speezifischem Inhibitor** gebunden
* NF-kB und I-KB
* TF Dimere: **Partner** **bestimmt Aktivität**
* Eg bHLH und bZip Proteine
* Ein Ligand wird für Aktivität/Inaktivität des TFs benötigt
* Hormonrezeptor-TFs im Kern
27
Hormone
* Hormone sind chemische **Botenstoffe**
* Aktionsweise
* **Endokrin** – auf distale Zellen
* **Parakrin** – auf benachbarte Zellen
* **Autokrin** – auf die hormonproduzierende Zelle selbst
* Aktiv bei sehr **niedrigen Konzentration**
* Anzahl: hunderte im Menschen, Funktionen
* Reproduktion – Östrogen, Testosterone, Progesterone
* Metabolismus – Thyroidhormon, TSH, GH
* Stress – Glucocorticoise, ACTH, CRF
* Blutdruck – Aldosterone, Renin, Angiotensin, Vasopressin
* Calcium-Homöostase – Vitamin D3, Calcitonin, PH
* Vitamine als Hormone
* Vitamin A//Retinsäure
* Vitamin D3
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Hormone, die an TFs im Kern binden
* Retinsäure
* Vitamin A Derivat
* Entwicklungsprozesse,Zellwachstum
* spielt bei Tumoren, Zellproliferation
* Acnebehandlung
* Cortisol
* Zuckerstoffwechsel
* Thyroxine
* Calciumstoffwechel
* * Bewegen sich frei durch Gewebe/Membranen
* membrangaengig
* Können dann dort mit Proteinen interagieren
* Liganden, die über die Membran diffundieren können
29
Hormonrezeptor-Transkriptionsfaktoren
* Binden Hormone und ermöglichen so Import in ZK
* Dazugehörigen TF/Kernrezeptoren besitzen unterschiedliche Längen, da v.A. variable Domänen in ihren Längen variieren
* Jeder hat sein eigenes DNA-Zielelement
* DNA-Bindedomäne ist Cys-Cys Zinfinger Paar
* * Wandern in Kehren ein
* Ligand-Bindedomäne
* Konserviert, da die Metabolite ähnliche Struktur haben
* Binden an Metabolite
* DNA-Bindedomäne
* Hoch-konserviert
* Bindet DNA
* Spezifisch – Jeder hat sein eigenes DNA-Zielelement
* Ist ein Cys-Cys Zinkfinger-Paar
* Der 1. Finger bindet DNA
* Kurze Region in Fingr 1 bestimmt DNA-Bindespezifität (P-box)
* Der 2. Finger führt zur Dimerisierung D-Box)
* Variable Domäne
* Nicht konserviert
* Variabel, v.a. in der Länge
* Aktivierungsdomäne
30
Transkriptionsfaktoren/Kernrezeptoren von Hormonen, auch Hormonrezeptoren
* der Rezeptor dieser Liganden sind Transkriptionsfaktoren
* Bestandtweile der Rezeptoren
* Ligandenbindende-Domaene
* auch ähnlich, da Liganden ähnliche Strukturen haben
* DNA-Bindende-Domäne
* konserviert
* Variable Domäne
* aktivierungsdomäne, ist Transkriptionsfaktor
31
Zielsequenzen der Hormonrezeptoren
* Jeder Hormonrezeptor hat eigenes DNA-Zielelement
* TF wirken als Dimere (Homo/Hetero)
* Zielsequenze entsprechend
* ca. 6 nt
* verdoppelt vorliegend
* Homodimer: palindromisch an Anfang und Ende der Sequenz
* Heterodimer: Sequenz unter Umstaenden komplexer
* direkter repeat
* ¨ähnlich
32
DNA-binde-Domäne der Hormonrezeptoren
* Wie kommts zur spez. der DNA-Bindung
* an einem der ersten zwei Cys-Cys Zinkfiner-Paar
* der 1. Finger bindet DNA
* Kurze Region in Finger 1 bestimmt DNA-Bindespezifität
* machen eigentliche Spezifitaet aus
* der 2. Finger führt zur Dimerisierung
33
Wirkungsweise hormonrezeptor
* Bindung des Hormons erlaubt Import in den Zellkern
* Rezeptor binden im Cytosol Ligand (Hormon) à Konformationsänderung
* Kann in Kern importiert werden
34
Bedeutung von Hormonrezeptoren
* Erbkrankheuten basierend auf Mutationen in Hormonezeptoren
* Steroidhormonrezeptoren
* Defekter Rezeptor für ACTH (Adrenocorticotropes Hormon): Crushings Synsdrom
* Nichtfunktioneller Androgenrezepptor
* Genotyp männlich, aber äußerlich weiblich
* Glucocorticoidrezeptordefekt: Bluthochdruck; Nierenschäden
* Andere Rezeptrn
* Thyroidhormonrezeptir defekt: ADHD
Retinsäurerezeptiir defekt: Leukämie
