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Genetik > VL 5: Replikation > Flashcards

VL 5: Replikation Flashcards

1
Q

DIe Replikation von DNA

A
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Q

Formale Möglichkeiten wie ein DNA-Molekül repliziert werden kann

A
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3
Q

Meselson Stahl Experiment

A
  • Durchführung an E.coli
  • Grundlage: chem. Markierung DNA, nach Replikation, nur eine Hälfte des Tochter-DNA-Doppelstrang weist Markierung auf
  • Marker: Stickstoffisotop 15N
    • Beifügung 15NH4Cl zum Kulturmedium
    • Einbau in heterozyklischen Basen der DNA
  • 14 Generationen wachsen lassen
  • → Bakterielle DNA ist mit diesem Sticksttoffisotop gesätigt
  • Auswechslung des Mediums
  • Weitere Replikationsrunden 14N
  • 15N und 14N-haltige DNA-Stränge aufgrund Dichteunterschieds durch Dichtegradienten-Gleichgewichtszentrifugation trennbar
  • Aufzucht von E.Coli in Medium mit schwerem Stickstoff-Angebot
    • Alle DNA 15N
  • Zentrifugieren, Aufnahme in Medium mit Standard Stickstoff (14N), 2 Generationen wachsen lassen
    • nach Gen 1: nur mittelschwere DNA (koennte auch dispersiv sein)**
    • nach Gen 2: je zur Hälfte mittelschwer und normale DNA

** Wie kann man schon an dieser Stelle wissen, dass Replikaiton semikonservativ is?

→ Trennung der DNA Stränge. Wenn trotzdem mittelschwer, dann dispersiv, wenn zwei Banden erscheinen, mittelschwer + normal, dann semikonservativ

  • Relative Mengen innerhab der Gesamt-DNA ermittelbar
  • Nach 1 Generation in 14N-haltigen Medium
  • Doppelhelix besitzt Schwimmdichte, die einen Mittelwert zwischen der Dichte völlig 14N-markierter DNA und 15N-markierter DNA
  • à 50/50 Gehalt beider Isotope
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4
Q

Das Meselson-Stahl Experiment

A
  • nachweis für semikonservative Replikation
  • selbst nach zweiter Generation nachweisbar, dass semikonservativ sein muss
    • Auftrennung der DNA
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5
Q

Replikationsinitiation

A
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6
Q

Replikon-Modell

A
  • Initiation benötigt
    • Replikaitonsursprung
    • Replikaitonsinitiator
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7
Q

Struktur von Replikatoren (ORIs –> Origin of Replication)

A

Replikaitonsursprung

  • 2 Typen von Elementen
    • Erkennungsstellen für DNA Binde-Proteinen (grün), 9-mer
    • wo eigentliche Initiation beginnt (blau), 13-mer
      • AT-reich (nicht so stabil wie GC)
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8
Q

Initiation der DNA-Replikation in e.coli

A

(a) DnaA-ATP erkennt 9-mer
* ATP gebunden hohe Aff. für Zielseq
(b) Konformationsänderung

  • DNA biegt
  • Torsionskräfte
  • Aufschmelzen der 13mere (instabil AT-reich)

(c) DnaB und DNAC Helicase aktiviert

  • Helicase zerlegt Doppelstränge
  • ATP verbrauch

(d) nehmen Stränge auseinander
(e) Primase produziert RNA-Primer

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9
Q

Initiation der DNA-Replikation in e.coli II

A

(f) DNA Polymerase III holoenzym

  • 2 katalytisch aktive Einheiten
  • versch UE
  • beide Richtungen

(g) 5’-3’ Richtung
(h) Kettenverlängrerung

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10
Q

Komponenten des Replikaitonsapparats

A
  • DNA-Helicase
  • DNA-abhängige RNA-Polymerase: Primase
  • DNA-abhängige DNA_Polymerase Pol III
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11
Q

Helicase Wirkungsweise

A
  • unter ATP-Verbrauch
  • Trennung beider Stränge
  • Kristallstruktur
  • Hexagonaler Ring
  • strukturelle Assymmetrie
  • UE
    • 6 unterschiedliche ATP bindende Stellen
      • 2 ATP
      • 2 ADP + P
      • 2 leer
    • shift von Konformationen
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12
Q

DNA-abhängige RNA-Polymerase: Primase

A
  • initiiert DNA Synthese durch RNA Primer, der von Primase synthetisiert wird
  • Primase synthetisiert RNA Primer
  • 1 pro sek
  • Primer sind 11 bp
  • macht viele Fehler
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13
Q

DNA-abhängige DNA-Polymerase Pol III

A
  • trägt eigentliche Polymerisierungslast
  • extrem effizient
  • innerhalb 30 min ganzes e.coli Genom repliziert
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14
Q

DNA Polymerasen in E.coli

A
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15
Q

welche Polymerase am seltesten?

A
  • DNA Polymerase III
  • 10-20 Moleküle
  • nur ein Molekül um eine DNA zu replizieren
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16
Q

Biochemie der DNA-Polymerasen

A
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17
Q

Die durch DNA-Polymerase katalysierte Strangverlängerung

A
  1. Nucleophiler Angridd des 3’OH Primer-Endes auf das alpha-Phosphat des freuen Nucleotids
  2. Bildungeiner Phosphodiester Bindung
  3. Freisetzung von Pyrophosphat
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18
Q

DNA Polymerase III Struktur

A
  • viele UE
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19
Q

beta-Untereinheit

A
  • Prozessivität
  • Ringmolekül
  • aus 2 UE
  • auf DNA geladen
  • Ringklemme der zwei UE
  • verhindert Runterfallen
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20
Q

Beladung der Sliding Clamp, Ringklemme

A
  • ATP-Verbrauch
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21
Q

Zwei Polymerase III Moleküle sind an der Replikationsgabel miteinander verbunden

A
22
Q

Korrekturfunktion

A
  • reduziert Fehlerrate >1000 fach
  • Korrektur per 3’-5’ Exonukleaseaktivität von DNA Polymerase III
  • Genauigkeit:
  • wie häufig macht Replikationsenzym Fehler?
    • alle 10 000 000 bp
  • Epsilon UE
23
Q

Lagging Strand

A
  • Folgestrang verläuft 5’-3’
  • Polymerase in 3’.5’-Richtung
  • okazaki fragmente
  • Ligase verknüpft

Lagging Strand Synthese

a) RNA oligonukleotide (primer) wird von DNA kopiert
b) DNA Polymerase elongiert RNA Primer mit neuer DNA
c) DNA-Pol entfernt 5’RNA am Ende des benachbarten Fragments und
d) DNA Ligase verknüpft benachbarte Fragmente

24
Q

Wie könnte man das Problem der Replikation lösen?

A
  • kein antiparalleler Strang
  • andere Chemie, die erlaubt in andere Richtung zu lesen
  • einzelsträngige DNA
25
Q

Replikationsgabel

A

loop

26
Q

DNA Polymerase I in e.coli

A
  • kann in beide Richtungen abbauen
  • Synthese nur in 3’-5’-Richtung aufbauen
  • Klenow-Fragment
    • DNA-Polymerase
    • 3’-5’Exonuclease
27
Q

Funktion der 3’-5’ Exonuklease von Pol I

A
  • nur ungepaarte Nukleotide am 3’-Ende werden entfernt
  • Radioaktivität verschwindet
  • radioaktiv markierte Templates (TATA)
    • bei Inkubation des Enzyms mit Template, radioaktivitaet bleibt erhalten
  • falsch gepaarte radioaktive Templates
    • bei Inkubation mit Enzym Pol I werden schnell entfernt
  • Nur ungepaarte Nukleotide am 3’-Ende werden entfernt
28
Q

Warum gibt es nur 5’-3’-Kettenverlängerungen?

A
  • energetische Bindung fehlt
29
Q

Die 5’-3’ Exonuklease Aktivität von Pol I

A
  • Polymerase entfernt den Primer
  • Auffuellen des Strangs
  • Ligase
    • NAD Cofaktor,
    • Anhaenung AMP, energetische Gruppe
    • Attacke
30
Q

DNA-Ligase

A
  • Basenpaarung führt zu antiparallele Anordnung der DNA-Einzelstränge
  • Problem bei Neusynthese an gleichen Initiattionspunkt
  • Keine kontinuierliche Synhese möglich
  • Teilstücke (<1000 bp) Okazakifragmente
  • Kovalente Bindung
31
Q

DNA Replikation in E.coli (Genom ca. 4 x 106 bp)

A
  • Replikation wird an oriC initiiert
  • Replation dauert ca. 40 min
    • Pol III synthetisiert 1000 Nucleotide/Sekunde
    • Pol I synthetisiert ca. 10 Nukleotide/Sekunde
    • Primase synthetisiert ca. 30-60 Nucleotide/Sekunde
32
Q

Teilung e.coli 20 min, Replikation e.coli 40 min! How?

A
  • 2 Replikationsgabeln!
  • in schnellwachenden e.coli Zellen beginnt eine neue Runde der Replikation bereits vor dem Ende der Zellteilung
    *
33
Q

(!) Wie OriC stillhalten?

A
  • Replikationsursprung ori: GATC x 11
  • DAM Methyliert am A
  • nach Replikation ist A nur am parentalen Strang methyliert (hemimethyliert)
  • nur wenn doppelt methyliert kann DnaA-protein binden
  • DnA-ATP
    • bindet an ORI, leitet Aufspaltung ein
    • unter Spaltung ATP
    • DnaA-ADP nicht in der Lage ORI wieder anzufeuern
    • Vorgang ADP zu ATP langsam
    • DnaA-ATP bindet noch an zwei andere Seq-Elemente der DNA
    • Gensequenz fuer DnA-Protein auf Chromosom, hat auch Promotor, im Promotor GATC, Dna-ATP bindet an eigenen Promotor und wirkt reprimierend → autoregulatorisch
    • eine Gensequenz mit 5 Bindestellen für DnaA-ATP (datA) → reduziert die Konzentration von DnaA-ATP
34
Q

Replikationsmodus: Rolling-Circle-Replikation

A
35
Q

Multiple Replikationsursprünge - Replikation eukaryotischer Chromosomen

A
  • 25 000 ori s
  • Euchromatin mehr Ori s als Heterochromatin
  • jedes Chromosom trägt viele Origins
    *
36
Q

Termination der Replikation

A
  • An Terminatorsequenzen, die von Tus-Proteinen gebunden werden
  • Terminationssequenzen, an die Proteine binden, die Helicase inhibieren, sind in einer best. Reihenfolge
  • Ringe Verhaken sich → Concatemere, werden von Topoisomerase II aufgelöst
37
Q

Minimalwissen

A
  • Enzyme der Replikation
  • Wie wird Replikation initiiert? Wie ist die Initiation reguliert?
  • Was sind Okazaki-Fregmente?
  • Wie sieht die Replikationsgabel aus?
  • Wieso werden Nukleinsäuren immer in 5’-3’-Richtung verlängert?
38
Q

Replikation in Eukaryoten: multiple Replikationsursprünge

A
  • mehrere Replikationsgabeln
  • 25000 oris
38
Q

Replikation in Eukaryoten: multiple Replikationsursprünge

A
  • mehrere Replikationsgabeln
  • 25000 oris
  • 8 stunden dauert replikation
  • urspruenge mit autoradiogramm sichtbar machen., neu synthetisierte stellen sichtbar
39
Q

Wechsel Polymerasen in Eukaryoten

A
  • DNA Pol alpha/ Primase kann RNA Primer synthetisieren und DNA
  • DNA Pol delta und epsilon sind aber schneller
  • kommen nach
40
Q

Regulation der Replikation in Eukaryoten

A
  • Während der S-Phase muss die gesamte DNA 1x repliziert werden
  • es darf keine Regionen geben, die unrepliziert bleiben
    • führt zu Chromsomenbr¨chen während der Segregation
  • es darf keine Bereiche geben, die mehrmals repliziert wurden
    • führt zu Kopezahleffekten
  • Bei großen Zahl von Replikationsursprüngen:
    • wie kann dies gewährleistet werden?
41
Q

Wie kann die große Zahl von Replikationsursprüngen reguliert werden ( also nicht zu viel Replikation?)

A
  • Replikatoren (oris) werden durch die Replikation inaktiviert
  • Wenn ORI gefeuert wurde dann ist ORI nicht mehr in der Lage Replikation zu initiieren
  • Weil an Zellzyklus Faktoren (Cdks) gekoppelt ist
  • Bildung des Präreplikativen Komplex (pre-RC) ist abhängig von diesen Zellzyklusfaktoren
42
Q

Formierung des Präreplikativen Komplexes

A
  • pre-RC
  • Assemblierung ORC auf ORI
  • ORC Origin Recognition Complex (6 Proteine), ist während des gesamten Zellzyklus an Origin gebunden
    • Platform für weitere Komponenten
  • Cdc6 und Ctd1 sind Helicase-loading Proteine, die Bindung an ORC erfolgt in G1 → “Licensing Factor”
  • Licensing Factor oder auch Der Mcm2-7 Komplex ist die Replikationsgabel-Helicase
  • Dieser Komplex entsteht in G1, wird aber erst aktiv in der S-Phase
43
Q

Cyclin-abhängige Kinasen aktivieren die Replikation zellzyklusabhängig

A
  • Kinasen selber entscheiden ueber ihre Kinaseaktivitaet
  • Kinasen sind Enzyme die ueber ATP-Verbrauch Phosphorylierungen durchfuehren
  • Phosphorylierungen veraendern eigenschaften Proteine
  • Cycline sind kleine Proteine
  • fungieren als Schalter für Kinasen
  • niedrige Aktivität der Kinase:
    • pre-RC-Formierung erlaubt
    • Aktivierung nicht erlaubt
  • hohe Aktivität der Kinase
    • pre-RC-Formierung inhibiert
    • Aktivierung existierender pre-RC
44
Q

Cyclin-Aktivitaet waehrend des Zellzyklus

A
  • G1: niedrig, Assemblierungsphase, pre-RCs werden geformt
  • S Phase: Cyclin Konzentration hoch, Aktivierungsphase, Helicase und Polymerase machen ihren Job, Verdopplung der pre-RC,
  • G2: pre-RC schrumpft
  • M: Verdopplung in Zellteilung, Mitosephase
45
Q

Cyclin Konzentrationen während des Zellzyklus

A
  • verschiedene Signalproteine akkumulieren zu unterschiedlichen Zeitpunkten
  • Interagieren dann mit Kinase (als Kofaktor mehr oder weniger)
  • andere Cycline aktivieren andere Kinasen
  • zu best. Zeitpunkten im Zellzyklus
  • je nachdem welche Cycline da sind und welche Kinasen da sind
  • Set von Proteinen aktivieren u.a. Licensing Faktoren
46
Q

Termination: das Probelm an Chromosomenenden

A
  • Lagging strand kann am Telomerende nicht vollständig repliziert werden
  • ein Chromosom verkürzt sich
    *
47
Q

Telomerase

A
  • fuegt kurze repetitive Sequenzen an das 3’ Ende an
  • Telomerase ist eine Reverse Transkriptase (=RNA-abhaengige DNA-Polymerase mit einer eigenen RNA als Matrize)
    *
48
Q

Telomere

A
  • Schutzkappen für Chromosomen
  • machen Loops, da alles dieselbe Sequenz
  • Selbsthybridisierung
  • Schutz vor Exonukleasen
  • Schelterin: Proteine fuer Stabilisierung

→ dienen dem Schutz der Chromosomen

49
Q

Telomerase Regulation

A
  • Die Telomerase ist in somatischen Zellen nicht oder wenig aktiv. hier verkürzen sich die Telomere tatsächlich
  • In der Keimbahn, in Stammzellen und in Tumorzellen ist die Telomerase dagegen aktiviert

Genetik (20 decks)

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