VL4 DNA Technologie Flashcards
DNA künstlich vervielfältigen
PCR:
- Schmelzen (reversibler Prozess ™=GC*2,44+69,4°C) 96°C
- schnell Abkühlen 46°C für Primer Annealing (20nt einzelstränig und komplementär zur DNA )
- aufheizen auf 76°C Taq-Polymerase (Enzyme aus hyperthermophile MO’s (thermus aquaticus )
- Wiederholung
Tipp für praktische DNA
weniger AusgangsDNA für PCR verwenden, sonst hybridisieren die DNA Stränge wieder zusammen.
PCR Stränge
- Zyklus synthetisiert lange Stände
- Zyklus synthetisiert kurze Stränge
- Zyklus nur noch kurze Stränge
Ende 30 Zyklen
Anzahl der Kopien 2^n
Limitierende Factoren:
- Nukleotide
- Primer
- Taq-Polymerasen
Primer Anforderungen
- Selbst-Komplementarität
- unspezifische Bindungsstellen
- Schmelztemperatur
- Annealing Temperatur
Primer Probleme
bindet an sich selbst oder bildet ein Dimer aus und kann so nicht mehr an AusgangsDNA binden.
Hybridisierungstemperatur
ist die Durchschnittstemperatur von PRimer und DNA
Ta= ((™1 +™2)/2)-3°C
™ 1 und 2 dürfen nicht weiter als 5 °C auseinander liegen
DNA Synthese
siehe VL 4 Folie 22-33
Schutzgruppen für BASen
A-Benzyl
C-Acyl
G-iso-Butyl
T braucht keine
Schutzgruppe für das 5’ ende
nur temporär:
Dimethoxytrityl (DMT) bindet an 5’ OH
Feste Phase der DNA-Synthese
Silikakügelchen- Spacer (ende hat ein Säurechlorid, diese Reagiert mit dem 3’ OH des Zuckers )
Deshalb DNA billiger für RNA musste 2’ OH noch geschützt werden.
Nächster Baustein
Phospoamiditen (+III) aktiviert, regiert mit der Base, die fixiert ist.
technische DNA-Synthese
erfolgt von 3’ zu 5’
Aufbereitung der synthetisierten DNA
- DNA vom Träger lösen
- Schutzgruppen lösen
- aus Phosphit Phosphat machen
erfolgt simultan, Spaltung mit NH3 und I2/H20
als leztes in Säure baden, zum entfernen der DMT
Zusammenfügen eines künstlichen Gens
1) Synthese überlappender Polynukleotide
2) Ligation mit T4 DNA-Ligase
Key ist ein guter Nukleotid Design
