13. Les méthodes de détection Flashcards
Énumère les méthodes de détection traditionnelles
- Méthodes de culture :
> dénombrement de colonies après culture sur gélose
> dénombrement sur gélose après filtration
> méthode du nombre le plus probable (NPN)
> dénombrement par turbidimétrie
a. Défini le principe de la méthode de culture : dénombrement de colonies après culture sur gélose.
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Un inoculum de chaque dilution est utilisé pour ensemencer une gélose nutritive. L’isolement des colonies peut se faire par l’étalement en profondeur (« pour plate ») ou d’étalement en surface (« spread plate »). Après incubation, on effectue un compte des colonies d’aspect caractéristique et une confirmation par des tests biochimiques si nécessaire.
Nombre de colonies sur la boîte x inverse de la concentration de l’échantillon = nombre de bactéries par millilitre. (Par exemple, s’il y a 32 colonies sur la surface d’une boîte inoculée avec une solution diluée à 1/10 000, le nombre de bactéries est de 32 × 10 000 = 320 000 bactéries par millilitre)
b.
Avantages :
- à compléter
Inconvénients :
- fastidieuses
- nécessitent un matériel assez lourd à préparer
- ne donnent de résultat qu’après plusieurs jours en plus des étapes d’enrichissement inévitables dans certains cas de recherche de microorganismes.
a. Défini le principe de la méthode de culture : dénombrement sur gélose après filtration.
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Technique appliquée dans le cas des liquides alimentaires limpides.
Elle consiste à filtrer l’échantillon.
Le filtre est ensuite placé sur une gélose nutritive et enfin incubé.
Le résultat exprime le nombre de colonies formées par volume utilisé.
b.
Avantages :
- permet de dénombrer des flores particulières si l’on choisit le type de gélose et les conditions d’incubations.
Inconvénients :
??
a. Défini le principe de la méthode de culture : méthode du nombre le plus probable (NPN).
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Consiste à effectuer des ensemencements répétitifs de chaque dilution de l’échantillon alimentaire dans des bouillons nutritifs liquides.
Après incubation, les tubes ensemencés sont notés (+) s’il y a eu croissance, ou (-) dans le cas contraire.
Un estimation de la concentration microbienne est obtenue par comparaison des résultats de croissance ou non avec des tables statistiques qui donnent un nbr le + probable par gramme de produit.
b.
Avantages :
- Simple
- Facilement adaptable au dénombrement de différents groupes microbiens
Inconvénients :
- imprécision de l’estimation
- absence de repères permettant de vérifier la nature du MO en croissance
a. Défini le principe de la méthode de culture : dénombrement par turbidimétrie.
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Lorsque des cellules sont en suspension dans un milieu liquide traversé par un faisceau lumineux monochromatique, la quantité de lumière absorbée et dispersée par la suspension est fonction de la concentration des cellules et de leur taille.
Relation absorbance-concentration en cellules est linéaire dans une gamme de concentrations.
Si on connaît la droite (étalon) représentant l’absorbance de la suspension en fonction de la concentration en cellules, il suffit de mesurer l’absorbance d’une suspension de concentration inconnue pour déterminer graphiquement le nombre de cellules qu’elle contient. Pour obtenir une telle droite, une gamme de dilutions de la suspension connue et l’absorbance de chaque dilution est mesurée avec un spectrophotomètre
b.
Avantages : ??
Inconvénients : ??
Énumère les méthodes de détection alternatives.
Techniques immunologiques:
> réaction d’agglutination
> séparation immuno-magnétique
> test d’immunodiffusion
> dosage immunoenzymatique sur support solide (ELISA)
Techniques de biologie moléculaire:
> méthodes d’hybridation moléculaire
> méthode d’amplification (PCR et RT-PCR)
Autres méthodes :
> dosage par bioluminescence de l’ATP cellulaire ou ATP-métrie
> mesure de l’impédance
> mesure de l’activité réductrice
a. Défini le principe de la technique immunologique : réaction d’agglutination
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Le couplage d’anticorps sur des particules de latex permet le criblage d’échantillons pour un microorganisme en particulier.
En présence d’un microorganisme (antigène), des agrégats antigène-anticorps visibles sont formés. La réaction observée s’appelle agglutination (ce sont les particules d’immunoglobulines qui s’agglutinent).
b. Avantages :
- simple
- spécifique
Inconvénients :
- étape de pré-enrichissement souvent nécessaire
- pas très sensible : 10^6 UFC sont nécessaires pour une réaction visible.
a. Défini le principe de la technique immunologique : séparation immuno-magnétique.
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Dans la technique de séparation immunoma- gnétique, les anticorps sont couplés à des billes magnétiques.
Conçue pour séparer le microorganisme ciblé de l’échantillon.
Le complexe billes magnétiques et anticorps est ajouté à un échantillon (généralement milieu de culture) et incubé afin de permettre la réaction d’affinité avec l’antigène. L’antigène (MO) capté par l’anticorps immobilisé sur les billes est isolé de l’échantillon par l’application d’un aimant.
Ensuite, l’isolat contenant les MO peut être utilisé pour inocluer un milieu de culture et être dénombré sur gélose ou utilisé dans d’autres systèmes de détection (ELISA, PCR, etc).
b. Avantages : ??
Inconvénients : ??
a. Défini le principe de la technique immunologique : test d’immunodiffusion.
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Ces tests sont des réactions de précipitation de complexe anticorps-antigène qui se déroule sur gélose. Un précipité visible est formé sous la forme d’une ligne blanche.
b. ??
a. Défini le principe de la technique immunologique : dosage immunoenzymatique sur support solide (ELISA).
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composé coloré pouvant être mesuré par spectrophotométrie. (EIA)
1. Immobilisation de l’anticorps de capture;
2. Ajout du MO;
3. Capture du MO;
4. Ajout de l’anticorps de détection marqué d’une enzyme;
5. Élimination des anticorps de détection libres;
6. Ajout d’un substrat chromogène de l’enzyme;
7. Apparition de la coloration.
b. Avantages : ??
Inconvénients : ??
a. Défini le principe de la technique de biologie moléculaire : méthode d’hybridation moléculaire.
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Le principe de l’hybridation moléculaire repose sur l’appariement spécifique des paires de bases complémentaires entre elles grâce aux liaisons hydrogènes pour former ce qu’on appelle un duplex.
À basses T°, les simples brins d’acides nucléiques tendent à se stabiliser et à former un complexe bicaténaire et on parle alors d’hybridation moléculaire.
Cette hybridation est possible lorsque les deux chaînes monocaténaires d’ADN ou d’ARN possèdent au moins qq courtes séquences complémentaires.
b.
Avantages :
- permet d’identifier les MO dont la morphologie ne fournit aucune information taxonomique discriminante.
- peut se faire soit sur des organismes cultivés soit sur des populations naturelles qui sont très difficilement isolables en culture.
Inconvénients :
- les sondes commercialisées pour le diagnostic microbiologique des aliments ont un seuil de détection encore trop faible ( 10^5 germes/ml)
a. Défini le principe de la technique de biologie moléculaire : méthodes d’amplification (PCR/ RT-PCR).
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Exploite certaines caractéristiques du processus de la réplication de l’ADN pour produire un nombre élevé de copies d’une séquence particulière d’ADN. Cette technique permet une production exponentielle de 105 à 106 fois d’un fragment d’ADN défini et est capable de détecter une seule copie d’ADN.
PCR : 3 étapes (dénaturation, appariement (hybridation) et élongation (polymérisation).
RT-PCR : amplification de l’ARN en 2 étapes (transcription inverse et amplification (PCR))
b.
Avantages :
- spécifiques
Inconvénients :
- ??
a. Défini le principe des autres méthodes : dosage par bioluminescence de l’ATP cellulaire ou ATP-métrie.
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Permet le dosage de l’ATP contenu dans un produit alimentaire pour estimer le nombre de cellules en activité.
Les cellules vivantes produisent et stockent en réserve l’ATP , contrairement aux cellules mortes qui le perdent rapidement.
b. Avantages :
- utile pour évaluer la contamination microbienne de l’eau ou apprécier les levains en fermentation.
Inconvénients :
- ne s’appliquent pas aux produits crus, car ils renferment des cellules vivantes et leur ATP causerait une interférence.
a. Défini le principe des autres méthodes : mesure de l’impédance.
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Permet d’évaluer la charge microbienne d’un produit alimentaire par la mesure de la variation de l’impédance (résistance électrique) d’un milieu de culture ensemencé avec l’échantillon à évaluer.
La croissance des MO génère des métabolites plus conducteurs qui diminuent la résistance électrique du milieu.
b. Avantages :
- on peut avoir estimation de la charge microbienne que renferment les aliments cuits, les céréales, la viande, les légumes congelés, etc.
Inconvénients : ??
a. Défini le principe des autres méthodes : mesure de l’activité réductrice.
b. Décrit ses avantages et ses inconvénients.
a. Technique de dénombrement qui utilise l’activité réductrice qui permet d’apprécier la charge microbienne suivant le potentiel d’oxydoréduction du milieu qui tend à diminuer lorsqu’il y a croissance microbienne.
Utilisation d’un indicateur ou colorants qui changent de couleur avec le potentiel d’oxydoréduction suite à un temps d’incubation.
Plus le nbr de MO actifs est élevé, plus la réduction est rapide.
b. Avantages :
- rapide
- peu coûteuse
- simple
Inconvénients :
- ne permet que l’évaluation de la contamination générale
