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Biología Molecular > Secuenciación de proteínas y cristalografía > Flashcards

Secuenciación de proteínas y cristalografía Flashcards

1
Q

Secuenciación de proteínas

A
  • Se busca conocer la estructura primaria
  • Ahora se puede determinar la secuencia de aminoácidos a partir del conocimiento de la secuencia del genoma
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Q

Científico que determinó la secuencia de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de la insulina

A

Frederick Sanger

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3
Q

Análisis de péptidos

A
  • La secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína está especificada genéticamente
  • Se clona la secuencia de ácidos nucleicos que la codifican y se clona a su vez la proteína para su estudio pudiendo hacer cambios en la secuencia
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4
Q

Flujo de trabajo

A
  1. Extracción de proteínas (cuantificación (Bradford))
  2. Separación de las proteínas (cromatografía de exclusión molecular, de afinidad, de intercambio iónico)
  3. Procesamiento para secuenciación
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5
Q

Procesamiento de secuenciación

A
  • Agentes reductores eliminan puentes disulfuro
  • Alquilación de cisteínas evita la formación de puentes disulfuro otra vez
  • Una hidrólisis completa permite determinar cuáles aminoácidos están presentes y en qué proporción
  • Digestiones individuales con 2 diferentes agentes para obtener péptidos menores a 3KDa, purificación de fragmentos, su secuenciación y determinación de la secuencia global por traslape de los fragmentos individuales
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6
Q

De los reactivos usados para la fragmentación de cadenas polipeptídicas, ¿cuál es el único que NO es una proteasa?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar

A

d) Bromuro de cianógeno

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7
Q

¿Qué reactivos hacen la ruptura de la cadena polipeptídica en el grupo amino del aminoácido indicado?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar

A

c) Asp-N-proteasa
e) Pepsina

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8
Q

¿Qué reactivos hacen la ruptura de la cadena polipeptídica en el extremo carboxilo del aminoácido indicado?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar

A

a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
d) Bromuro de cianógeno
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar

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9
Q

¿Qué reactivo hace la ruptura de la cadena polipeptídica en el extremo carboxilo de los aminoácidos ácido aspártico y ácido glutámico?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar

A

f) Staphylococcus aureus V8 proteasa

La Asp-N-proteasa hace lo mismo pero en el grupo amino de estos aminoácidos

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10
Q

¿Qué reactivo hace la ruptura de la cadena polipeptídica en más aminoácidos que cualquier otro reactivo?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar

A

e) Pepsina

Lo hace en 4: leucina, fenilalanina, triptófano y tirosina en sus grupos amino

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11
Q

¿Qué reactivo hace la ruptura de la cadena polipeptídica únicamente en el aminoácido metionina?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar

A

d) Bromuro de cianógeno

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12
Q

¿Qué reacciones se usan para identificar el aminoácido amino-terminal?

A
  • Sanger
  • Edman
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13
Q

¿Cuáles son las espectrometrías de masas?

A
  • MALDI (desorción/ionización láser asistida por matriz)
  • ESI (ionización por electroespray)
  • MS/MS (espectrometría de masas en tándem)
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14
Q

¿Cuál es el nombre del reactivo de Sanger?

A

2,4-dinitro-fluoro-fenilo

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15
Q

¿Qué tipo de reacción en la secuenciación de Sanger transforma el 2,4-dinitrofenil-péptido a 2,4-dinitrofenil del aminoácido N-terminal?

A

Hidrólisis ácida

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16
Q

¿Cuál es el nombre del reactivo de Edman?

A

Fenilisotiocianato

17
Q

Degradación de Edman

A
  • Al final se obtiene feniltiohidantoína del aminoácido N-terminal y queda el resto del péptido intacto
  • Se realiza gracias a una hidrólisis con un pH bajo
  • El aminoácido acortado e intacto vuelve a pasar por la reacción de Edman para determinar al nuevo aminoácido N-terminal
  • Empleada en secuenciadores automáticos que sólo pueden secuenciar los primeros 40 aminoácidos del extremo N-terminal ya que el rendimiento de la reacción no es del 100% y se pierde parte del péptido poco a poco
  • Se puede hidrolizar la proteína original y realizar la secuenciación de cada fragmento por separado
18
Q

Huella digital de la proteína

A
  • La secuencia de una proteína es única, por lo que al ser cortada origina un patrón peptídico específico
  • Los valores exactos del conjunto de masas moleculares de los péptidos es la representación única de la estructura primaria de una determinada proteína
19
Q

Espectro de masas

A
  • Es información bidimensional que representa la abundancia de los diferentes tipos de iones en función a la relación masa/carga de cada uno de ellos
  • Evidencia la relación masa/carga de los péptidos y se convierte en una huella digital de la proteína
20
Q

¿Qué pasaría si en la muestra inicial analizada estaba constituida por una mezcla de diferentes proteínas?

A

La búsqueda en las bases de datos de los patrones representativos de los diferentes péptidos permitiría identificar cuales serían esas proteína que conforman esa mezcla

21
Q

¿En qué consiste la espectrometría de masas?

A
  • Ionización de los componentes de la muestra en fase gasesosa
  • Separación de los iones resultantes de acuerdo a su relación masa/carga eléctrica, usando campos electromagnéticos en el vacío
  • Permite deducir la masa de la molécula
22
Q

¿Por qué la relación masa/carga no se podía aplicar para macromoléculas?

A

Porque el calentamiento para transitar a fase gasesosa las descomponía, pero en 1988 se desarrollaron 2 sistemas de ionización para solucionar esto

23
Q

¿Cuáles son los 3 componentes del espectrómetro y sus funciones?

A
  • Sistema de ionización: vaporización e ionización a partir de moléculas neutras
  • Analizador de masas: separación de los iones en función de su relación masa/carga eléctrica
  • Detector de iones: detección de iones formados
24
Q

Sistema de ionización MALDI

A
  • Muestras en fase sólida
    1. Irradiación de un láser hacia un matriz con el polipéptido
    2. Desorción (hay adsorción pero no se descompone
    3. Desolvatación e ionización
25
Q

Analizadores de masas

A
  • TOF (tiempo de vuelo)
  • TOF - TOF
  • Trampa de iones tridimensional
  • Q (quadrupolo)
26
Q

Sistema de ionización ESI

A
  • Muestras en fase líquida
  • Se introduce el analito (que será ionizado) disuelto en un solvente más volátil por un capilar de metal.
  • Debido a la repulsión de las cargas eléctricas, el líquido se sale del capilar y forma un aerosol, una nube de pequeñas gotas altamente cargadas.
  • Conforme el solvente se evapora, las moléculas de analito se aproximan, se repelen y finalmente, cuando la repulsión de las cargas positivas vence la tensión superficial, estallan las gotas (Explosión de Coulomb).
  • El proceso se repite hasta que el analito está libre de solvente, de modo que no quedan más que iones.
  • Los iones se mueven hacia el analizador de masa.
27
Q

TOF

A
  • La muestra de iones se acelera antes de entrar al tubo de tiempo de vuelo
  • Los iones más pesados se desplazan más lento, el tiempo que tardan en atravesar el tubo nos dice su masa
28
Q

TOF - TOF

A
  • Se puede abrir y cerrar rápidamente la compuerta de paso entre el 1° tubo drift y el tubo TOF
  • El aislamiento no funciona cuando el espectro está demasiado congestionado
  • Da un análisis más completo
29
Q

Quadropolo

A
  • Consiste en 4 barras metálicas de sección circular, rectas y paralelas
  • Se aplica un potencial constante que origina un movimiento lateral oscilante de los iones
  • Baja ciertas condiciones de potencial, un ion determinado puede moverse sin chocar con las barras e ingresar al detector
  • Funciona como un verdadero filtro de masas
30
Q

Trampa de iones

A
  • Los iones son atrapados aplicando una radiofrecuencia en la dirección radial y un potencial continuo repulsivo en la lente de salida
  • Ya que se acumulan, los iones salen de la trampa mediante un voltaje auxiliar
31
Q

MS/MS

A

2 espectrómetros en tandem

32
Q

Detección de iones e interpretación

A
  • Se detecta el flujo iónico, se amplifica y transmite a la computadora, donde se registra en forma de espectro de masas
  • La masa de los iones está en el eje de las abscisas y la intensidad de los mismos están en el eje de las ordenadas
  • El espectro de masas evidencia el número de componentes en la muestra y el peso molecular de cada componente
  • Se pueden determinar cofactores unidos, iones metálicos o modificaciones covalentes
33
Q

Cristalografía de rayos X

A
  • Es un método para determinar la estructura tridimensional de una macromolécula mediante el análisis del patrón de difracción de los rayos X por un compuesto cristalino
  • Determina la separación de los átomos en una red cristalina midiendo las ubicaciones de manchas producidas en una película fotográfica por un haz de rayos X difractado
34
Q

Resolución

A
  • La distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar 2 puntos como entidades separadas
  • Depende la longitud de onda de la luz; a menor longitud de luz, mayor resolución
  • Un haz de luz de una longitud de onda determinada no puede usarse para examinar detalles estructurales más pequeños que su propia longitud de onda
35
Q

Características verdaderas sobre la secuenciación de proteínas y cristalografía
a) Los agentes reductores, en el procesamiento de secuenciación, sólo se usa en proteínas de secuencias primarias
b) Después de que se realizó una hidrólisis completa de la secuencia de la proteína, no a fuerzas se tiene que hacer las digestiones individuales con 2 agentes diferentes
c) Luego de la digestión individual de las secuencias de las proteínas, se obtienen péptidos menores a 3KDa
d) Todas son verdaderas

A

b) Después de que se realizó una hidrólisis completa de la secuencia de la proteína, no a fuerzas se tiene que hacer las digestiones individuales con 2 agentes diferentes
c) Luego de la digestión individual de las secuencias de las proteínas, se obtienen péptidos menores a 3KDa

R =
Los agentes reductores, en el procesamiento de secuenciación,se usa en proteínas de secuencias primarias, terciarias y hasta cuarternarias

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