1
Q
EL ADN tiene la capacidad de formar copias de sí mismo, este proceso se lleva a cabo en la fase se Síntesis del ciclo celular.
Objetivo: conservar información genética.
Características:
- Semiconservativa
- Discontinua.
- Bidireccional:
a) Eucariotas: izq - derecha. Origen: DNA lineal, doble cadena.
b) Procariote: derecha-izquierda. DNA circulante de doble cadena.
A
DUPLICACIÓN Y REPLICACIÓN
2
Q
En cada replicación una molécula de ADN recién sintetizada conserva una de las cadenas originales y la otra es sintetizada.
A
Modelo SEMICONSERATIVO (Una cadena se conserva)
3
Q
Se sintetiza una molécula totalmente nueva, copia de la original, por lo que dos hebras nuevas se juntan y por otro lado las dos hebras viejas.
A
Modelo CONSERVATIVO (cadena nueva)
4
Q
Las cadenas hijas constan de fragmentos de cadena antigua y fragmentos de la nueva.
A
Modelo DISPERSO (mezcla de cadena nueva y vieja).
5
Q
En procariontes, único cromosoma existente contiene un sitio de replicación ORI (origen)
Se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos con dos puntos de crecimiento que se conoce como HORQUILLA DE REPLICACIÓN.
A
Replicación MONOFOCAL
(UN sitio ORI, inicia en la horquilla).
Procariotas
6
Q
En eucariontes: contiene múltiples sitios ORI (origen de la replicación) que se replican simultáneamente, lo que permite acortar el tiempo en el que se replica todo el ADN.
Sitios ricos en AT- replicaciones.
ARS - Secuencias de replicación autónoma.
A
Replicación MULTIFOCAL
(Varios sitios ORI)
Eucariotas
7
Q
Es discontinua porque una cadena a partir del origen sale continua, “Lagging strand” líder o conductora.
La otra cadena lo hace retazada en fragmentos “Lagging strand”, 1960-Okazaki.
- Hebra molde 3´-5´
-Hebra continua: 5´-3´.
-Hebra discontinua: 5´-3´ fragmentos.
A
Replicación DISCONTINUA
Una cadena continua y otra en fragmentos Legging strand”
8
Q
- ADN molde
- Proteínas SSB (proteínas ligantes de ADN de cadena sencilla).
- Helicasa
- Nucleótidos trifosfatados (ATP, TTP, GTP, CTP).
- DNA polimerasa I, II y III procarionte.
- RNA polimerasa cebador.
- Topoisomerasa (se pegan en torsión).
A
Requisitos para la duplicación / replicación.
9
Q
- Iniciación
- Elongación
- Terminación
A
Fases de la replicación / duplicación
10
Q
Se encuentra una cadena continua orientada de 5´ a 3´y otra cadena rezagada orientada de 3´a 5´ (son antiparalelas y actuan como molde para sintetizar las nuevas)
Los ARS (secuencias de replicación autonoma) (ricos en A-T) son reconocidos por las proteínas de reconocimiento del sitio de origen.
- La HELICAS hidroliza puentes de hidrógeno para abrir la doble hélice.
- Las RPA (proteinas estabilizadoras) se unen a la hebra sencilla para estabilizar la estructura.
- La PRIMASA sintetiza al cebador/primer/iniciador (cadena de ARN).
A partir de los puntos de iniciación se originan las BURBUJAS de replicación, las cuales presentan dos zonas con forma de Y llamadas HORQUILLAS de replicación que se van abriendo gradualmente a medida que se sintetiza nuevas hebras complementarias de ADN.
A
- INICIACIÓN de replicación.
- HELICASA rompe puentes de hidrógeno para separar hebras. Crea horquilla(donde inicia la replicación)
- PROTEINAS ESTABILIZADORAS mantienen separadas las hebras.
- PRIMASA sintetiza primer
11
Q
- Alargamiento de las cadenas del ADN: La síntesis en la cadena líder ocurre de forma continua, mientras que la hebra retrasada ocurre por fragmentos (F. Okazaki).
Los cebadores comienzan con la secuencia pppAG colocada al lado contrario de la secuencia 3´-GTC-5´ en el molde, es decir, sintetizan en sentido 5´-3´ (FRAGMENTOS DE OKAZAKI).
- Hebra continua =Leading strand (5´-3´).
- Hebra discontinua: Laggin strand (3´-5´). Se replica en dirección contraria.
La POLIMERASA se une e incorpora nucleótidos en forma complementaria a la cadena molde a partir del CEBADOR (primer) con ayuda de la PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación)
La hebra líder siempre se sintetiza primero.
-La horquilla avanza y la tensión delantera aumenta por lo que las TOPOISOMERASAS actuarán para liberarla.
- EXONUCLEASA: elimina primer
-DNA POLIMERASA: rellena los espacios donde había primers
A
ENLONGACIÓN de replicación
- Hebra continua =Leading strand (5´-3´).
- Hebra discontinua: Laggin strand (3´-5´). Se replica en dirección contraria.
-TOPOISOMERASAS libera la tensión de las hélices.
- PRIMASA: pone primer
- POLIMERASA: pone fragmento de Okazaki.
- EXONUCLEASA: elimina primer
- DNA POLIMERASA: rellena los espacios donde había primers
12
Q
- Procarionte: basta con llegar hasta el origen de nuevo.
- Eucariontes: Cuando se encuentren las regiones de los telómeros.
- DNA LIGASA se une a los fragmentos ADN
- Cuando la POLIMERASA llega al extremo se descopla el replisoma (proteínas de horquilla) y finaliza la replicación.
- El proceso de maduración ocurre cuando los fragmentos de Okazaki se unen, para ello se requiere eliminar primero los cebadores, la elongación del fragmento de ADN adyacente para rellenar el espacio y la unión de los extremos (RNAsa HI, ADN pol delta y ligasa.
- ADN RNAsa HI: Elimina al cebador.
- Pol Delta: rellena espacios.
- Ligasa: une extremos de los fragmentos.
A
TERMINACIÓN
- ADN LIGASA: une fragmentos de ADN en cada cadena (A-T y C-G).
- POLIMERASA descopla replisoma (horquilla).
Unión de los extremos:
- ADN RNAsa HI: Elimina al cebador.
- ADN Pol Delta: rellena espacios.
- Ligasa: une extremos de los fragmentos.
13
Q
es una proteína nuclear sintetizada en la fase G1 temprana y en la fase S del ciclo celular. Esta proteína se localiza en el núcleo y favorece la síntesis de ADN, ya que es un cofactor de la ADN polimerasa delta.
Tiene forma de anillo y actúa como un mosquetón que se desliza sobre el ADN y al que se enganchan diversas enzimas
A
antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA)
14
Q
- Helicasa,
- Proteínas de unión a cadena sencilla (SSB y RPA).
- Topoisomerasas.
- Primasa
- RNAsa HI
- Ligasa
- Telomerasa
- Antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA)
- ADN polimerasas
A
PROTEINAS que intervienen en la REPLICACIÓN
15
Q
Enzima encarga de separar las hebras por la ruptura de puentes de hidrógeno, requiere hidrólisis de ATP, ocasiona superenrrollamiento a los lados de la burbuja de replicación.
A
HELICASA:
rompe puentes de hidrógeno para separar hebras.
16
Q
EVITAN la formación de PUENTES DE HIDRÓGENO entre las cadenas separadas por la helicasa.
A
PROTEÍNAS de UNIÓN a CADENA SENCILLA:
- Single Strand Binding SSB
- Replicación protein A RPA.
17
Q
LIBERAN la TENSIÓN contorsional ocasionada por la helicasa, rompiendo enlaces fosfodiéster y luego volviéndolos a formar una vez liberada la tensión.
A
TOPOISOMERASAS:
rompe enlaces fosfodiéster para liberar tensión.
18
Q
Sintetiza pequeños fragmentos de ARN (8-10 nucleótidos) como primers o cebadores complementarios del ADN.
A
PRIMASA
crea primers
19
Q
Se encarga de retirar los cebadores de ARN.
A
RNAsa HI
Elimina primers.
20
Q
Cataliza la formación del enlace fosfodiéster entre nucleótidos contiguos.
A
LIGASA
Une nucleótidos formando enlaces fosfodiester.
21
Q
Es una ADN polimersa dirigida por ARN que permite el alargamiento de los telómeros (eucariontes).
A
TELOMERASA
Alargamiento de los telómeros.
22
Q
Forma una estructura toroide (dona) que se coloca alrededor de la cadena de ADN y permite la unión de la ADN polimerasa y su desplazamiento a lo largo de la cadena.
A
Antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA)
Dona que une ADN polimerasa a la cadena.
23
Q
Son enzimas capaces de sintetizar ADN nuevo a partir de una hebra patrón uniendo desoxirribonucleótidos en dirección 5´- 3´. Existen al menos 15 polimerasas.
A
ADN polimerasa
Sintetiza ADN nuevo
24
Q
Subunidad pequeña (Pri S). Funciona como primasa (sintetiza el RNA cebador).
La subunidad mayor, con la actividad de polimerasa de la Pol Alfa, alarga el cebador utilizando desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs).
Después de agregar 20 nucleótidos se separa y el resto del alargamiento es realizado por la Pol E (en la hebra conductora) y por la Pol delta (en la hebra retrasada).
- Compartimiento celular: Núcleo.
- Primasa asociada: si
- Función biológica: Replicación hebra retardada.
- No. de subunidades: 4.
A
Polimerasa ALFA (mayor) / PRIMASA (menor)
25
Está implicada en la reparación del DNA, en la supresión de bases y en el rellenado de espacios dejados en la hebra retrasada.
- Compartimiento celular: Núcleo.
- Primasa asociada: No.
- Función biológica: Reparación
- No. de subunidades: 1.
Polimerasa BETA
Reparación: Suprime bases y rellena espacios de las hebras.
26
Replica y repara el DNA mitocondrial.
- Compartimiento celular: Mitocondria.
- Primasa asociada: No
- Función biológica: Replicación ADN y mitocondrial.
- No. de subunidades: 4 isoformas.
Polimerasa Y
27
Altamente procesiva y con actividad de exonucleasa 3´- 5´, para corregir errores. Es la polimerasa que se encarga de la replicación de la hebra retrasada.
- Compartimiento celular: Núcleo.
- Primasa asociada: No.
- Función biológica: Replicación hebra conductora.
- No. de subunidades: 2.
Polimerasa DELTA
Replicación de hebra retrasada
28
Altamente procesiva y con actividad de exonucleasa 3´- 5´ para corregir errores. Es la polimerasa que se encarga de la replicación de hebra conductora.
- Compartimiento celular: Núcleo.
- Primasa asociada: No.
- Función biológica: Replicación adicional.
- No. de subunidades: ¿?
Polimerasa E
Replicación de hebra conductora.
29
La polimerasa se mueve uniendo primero la secuencia molde a los dedos y gira 60 grados en el sitio activo.
El pulgar une al ADN a medida que sale.
- Cuando un nucleótido se une, el dominio de los dedos gira 60 grados hacia la palma de la mano y las puntas de los dedos se mueven 30 grados.
-Estos cambios se revierten cuando el nucleótido es incorporado a la cadena de ADN.
- Cuando una base mal apareada ocupa el sitio catalítico, los dedos no pueden girar a la palma, esto deja el extremo 3´ libre para unirse al sitio activo de exonucleasa.
POLIMERASAS
-El dominio terminal N
30
La telomerasa se une a una molécula de ARN especial de la propia telomerasa que contiene una secuencia complementaria a la repetición telomérica.
La enzima extiende (añade nucleótidos) a la cadena sobresaliente de ADN telomérico al usar este ARN complementario como molde. Cuando la proyección tiene un largo suficiente, la maquinaria de replicación del ADN normal (es decir, la que usa cebadores de ARN y ADN polimerasa) puede sintetizar una cadena complementaria y se produce ADN de doble cadena.
- Tert: actúa como plantilla.
-Terc: Actúa como transcriptasa inversa.
REPLICACIÓN DE LOS TELÓMEROS
- Telomerasa se une a ARN
- Telomerasa se extiende (añade nucleótidos).
31
La toma de muestra y su manejo es tan importante como el análisis por si mismo.
Las muestras para extracción de ADN (o ARN) pueden usarse en:
-Pruebas de filiación
-Estudios forenses.
Preparación de muestras, EXTRACCIÓN y ANÁLISIS de ACIDOS NUCLEICOS.
32
Los fluidos biológicos potencialmente pueden contener agentes patógenos (VIH, hepatitis, meningitis, etc), por lo cual se debe evitar el contactocon la muestra mediante el uso de GUANTES, MASCARILLA y BATA, emplear material DESECHABLE y NO COMER, BEBER, NI FUMAR durante el proceso de recolección.
PROTECCIÓN del PERSONAL
33
1. La sangre absorbida sobre PAPEL FILTRO:
- Por punción de talón (bebes)
- Por punción de dedo.
2. Sangre ANTIGOAGULADA en TUBO: entre 1 y 5 ml de sangre con anticoagulante EDTA o CITRATO DE SODIO. 0
MUESTRAS DE SANGRE
34
Se realiza raspado con un hisopo de la mucosa bucal. El hisopo debe estar estéril.
La muestra debe congelarse a -20 °C, antes de 2 horas.
CÉLULAS de MUCOSA BUCAL
35
- Cadaver FRESCO: sin signos de avanzado estado de putrefacción.
- Cadaver en estado de PUTREFACCIÓN: inicial o avanzado.
Muestras de material CADAVÉRICO
36
- Tejidos BLANDOS: Biopsia con bisturí de fragmento muscular. Enfriar inmediatamente a -20°C .
- Material ÓSEO: Biopsia de huesos LARGOS (dedos, costillas, fémur, húmero).
- SANGRE: Por punción de la cavidad cardiaca. Si aún no se ha coagulado adicionar EDTA al 5%, de lo contrario se recolectan coágulos.
- PELOS: Deben tener una proporción del bulbo piloso, y no cortarlos. Muestra de 20-30 pelos.
* En todos los casos enfriar inmediatamente a -20°C.
Muestras de material CADAVÉRICO FRESCO
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Material óseo/ piezas dentarias: biopsia de hueso largo (10-12 cm). Eliminar tejido blando y realizar lavado con etanol al 95%.
Muestras de material cadavérico en estado de descomposición
38
- Manchas frescas: absorberlas en papel filtro y dejarlas secar a temperatura ambiente sin exposición a la luz solar.
- Manchas secas: Tomar la mancha por el borde sin rasparla y colocarla en sobre de papel. O bien, diluirla con buffer y luego absorberla con papel filtro.
- Hisopados vaginales/anales: Se tratan igual que los de mucosa bucal.
Muestras de manchas e hisopados
39
Uso de material libre de nucleasas.
-Rotulado de muestras (fecha, nombre de a quien pertenece, nombre del recolector, origen).
- Almacenarlas adecuadamente:
A) las muestras de SANGRE a <20 grados C (no congeladas).
B) muestras absorbidas en papel filtro no refrigerar y NO CONGELAR.
C) las demás muestras se deben de congelar a <20 grados C.
CUIDADOS de las MUESTRAS
40
- Fenol/ cloroformo.
- Cloruro de Cesio.
- Cromatografía por exclusión.
- Cromatografía de intercambio iónico.
- Salting out.
Técnicas de extracción de ADN
41
V: Buen rendimiento, todo tipo de ácidos nucleicos.
D: Fenol es tóxico y cáustico.
FENOL / CLOROFORMO
42
V: Alta pureza y rendimiento. Poca contaminación.
D: laborioso y tardado. Reactivos cancerígenos, material especializado.
CLORURO DE CESIO
43
V: rápido, alta densidad, reproducible.
D: recuperación ineficiente.
CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN
44
Rápido, alta densidad, reproducible.
| D: cantidad de nuestra pequeña.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
45
V: barato e inocuo
D: requiere mucha muestra
SALTING OUT
46
***
MÉTODO GENERAL de EXTRACCIÓN DE ADN
47
El conocimiento de la estructura del ADN ha permititdo el desarrollo de multitud de herramientas tecnológicas que explotan sus propiedades fisicoquímicas para analizar su implicación en problemas concretos.
- Tecnología del ADN recombinante.
- Secuenciación
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
- Southern blot, Northern blot y Western Blot.
HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
48
Verificación de pureza: índice 260/280.
| Debe estar entre 1.8 -2 ya que cerca de 1.8 se tiene DNA practicamente puro.
TÉCNICAS de EXTRACCIÓN de ADN
49
Método de separación molecular en el que el DNA, el RNA o las proteínas se separan en una matriz de gel según su peso molecular, gracias a la aplicación de un campo eléctrico para atraer las moléculas a través del gel en una dirección determinada.
ELECTROFORESIS
50
Consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel, segun su peso molecular o tamaño, movimiento generado por un campo eléctrico.
Principio de la ELECTROFORESIS
Migración de moléculas xPM o tamaño x campo eléctrico.
51
-Horizontal: Para ADN, geles de AGAROSA.
-Vertical: Para PROTEINAS o Acidos Nucleicos pequeños, geles de POLIACRILAMIDA (acrilamida y bis-acrilamida) Se ocupa para moléculas más pequeñas, más finos, ocupa una cámara vertical
que tienen:
-Gel separador
-Gel concentrador.
(compactar la muestra para que cuando entre al gel separador sea más eficiente la separación). Se ocupa para la mocreómica y la metabolómica.
Tipos de electroforesis
52
1. Preparación del gel
2. Mezclar la muestra con buffer de carga.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente.
5. Visualizar las bandas.
PROCEDIMIENTO de electroforesis
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Son dos electroforesis en una. El gel se recorta, el carril se mete a un segundo gel, se separa con otro criterio:se separa en función a su gradiente de pH. El pH será igual a su punto isoeléctrico. Se ve como puntitos.
Aplicaciones: para proteómica (estudio de proteínas) y metabolómica (estudio de los metabolitos).
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
54
Es una técnica de biología molecular ampliamente utilizado para la obtención de un gran número de copias de un segmento específico de ADN.
Amplificar = generar varias copias.
Objetivo: Obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Obtener copias de un segmento.
55
Polimerasas que resisten temperaturas altas. El termociclador (ciclos térmicos) es como una fotocopiadora, genera ciclos en periodos muy cortos y reproduce el sistema de replicación bacteriano. Tiene que ser ADN íntegro y debe de haber limpieza de que no se mezcle junto con otro ADN ajeno.
Termociclador
56
- ADN MOLDE: DNA puro del cual se quiere generar gran número de copias de un segmento.
- ADN POLIMERASA: Enzima que se encarga de polimerizar el DNA naciente. Se utiliza Taq polimerasa de Thermophilus aquaticus.
- DESOXINUCLEÓTIDOS (como hojas para hacer la amplificación): dTTP, dATP, dCTP, dGTP.
- AMORTIGUADOR (regula el pH): Buffer Tris- HCl a pH 8.4.
- CLORURO DE MAGNESIO: Cofactor de la polimerasa.
- INICIADORES (primers/cebadores): se diseñan de tal manera que reconozcan por complementariedad la secuencia que se quiere amplificar.
Reactivos que requiere la PCR
57
1. Desnaturalización. Calentamiento: aumenta temperatura a 94 grados, se rompe el ADN y se separa de la hebra complementaria.
2. ALINEAMIENTO: disminuye temperatura, los cebadores se unen (complementariedad) al primer.
3. ELONGACIÓN: Aumenta temperatura como 4 grados, la polimerasa reconoce al cebador y une nucleotidos, se elonga el primer.
En el termociclador ocurre este proceso varias veces.
La polimerasa se despega y se rompen los puentes de hidrógeno y se vuelve a desnaturalizar, se repite el ciclo. Mientras que El primer se queda unido a la nueva hebra. Se hacen entre 30 y 40 ciclos (1 minuto). Cada ciclo dura 4 minutos. Por cada ciclo se genera un número exponencial de copias hebras.
FASES de la PCR
58
Un ciclo de PCR consta de 3 etapas:
- 95° C: Desnaturalización por 30 seg.
- 55-60° C: Alineación por 30 o 40 seg.
- 72° C: Extensión, copiado por complementariedad del segmento seleccionado (1000 nucleótidos/min).
El termociclador generalmente completa 35 ciclos.
CICLO DE PCR
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- CONVENCIONAL (método general).
- ANIDADA : El producto de la primer amplificación se utiliza como molde para una segunda amplificación.
El diseño de los primers es complicada y en el proceso in vitro el nucleótido entre al revés, esta técnica lo evita.
- IN SITU: Se realiza en preparaciones fijadas sobre un portaobjetos (secciones histológicas o células). Acorta las muestras de análisis, detecta sitios de hibridacion usando marcadores florocromos.
1. Amplificación de ADN blanco
2. Detección por hibridación.
TIPOS de PCR
60
- MULTIPLEX: Se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Varios sitios, ampliación en varias secciones.
- PCR con TRANSCRIPTASA INVERSA: Se usa ARN como molde (primer), con una retrotranscriptasa se obtiene ADNc y a partir de este se realiza la amplificación.
- PCR en TIEMPO REAL: Amplifica y Se puede cuantificar la cantidad de ADN o ARN en la muestra original (fluorocromos o sondas específicos). Los nucleotidos que se ponen son marcados y se mide con un detector la cantidad de luz que emite el fluorocromo.
Otros TIPOS de PCR
61
- Se han podido amplificar segmentos de ADN de 40,000 años de antiguedad como momias humanas y animales extintos dando origen a la arqueología molecular y a la paleontología molecular.
- Rastrear el origen de los virus humanos.
- Estudios forenses (southern blot).
- Identificar agentes infecciosos (virus, bacterias, hongos).
- Detección de mutaciones.
- DNA fingerprinting (huella génica).
- Análisis de expresión génica.
APLICACIONES de la PCR
62
Son ENDONUCLEASAS que cortan enlaces fosfodiester en una secuencias específica denominada secuencia DIANA.
Se utilizan en bio molec para generar fragmentos de un DNA de interés y luego clonarlo, secuenciarlo o amplificarlo. Son la base de muchas técnicas.
Tres TIPOS: I, II, III.
- TIPO I: Cortan a cierta distancia la secuencia de reconocimiento, metilan y requieren ATP para desplazarse sobre la molécula.
- Tipo II: Reconocen secuencias palindrómicas específicas y dentro de ellas hacen el corte. Requieren Mg como cofactor, No ATP.
- Tipo III: Reconocen secuencias específicas y cortan de 5 a 8 bases antes o después de ellas. Tambien metilan y requieren ATP.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
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- Mapas de restricción y bibliotecas genómicas.
- Fragmentar ADN genómico para separarlo por electroforesis y hacer Southern blot.
- Corte de genes específicos para ser clonados o para tecnología del ADN recombinante.
APLICACIONES de las ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
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- Extremos romos
| - Extremos escalonados.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
65
Se refiere a una variedad de procesos que pueden usarse para producir copias.
Se clonan: genes, células, tejidos e incluso organismos completos.
Ej: Dolly. Tiene como función original estudiar un proceso biológico.
CLONACIÓN
66
Las clonas existen de forma natural en muchos organismos.
La producción de clonas en laboratorio se realiza insertando un gen de un organismo en un vector y se utilizan condiciones adecuadas para que el gen se multiplique.
Los animales clonados se reproducen a partir de óvulos a los que se les transfiere la información genética del animal de interés.
Las bacterias hacen clonas idénticas de la generación previa.
CLONACIÓN
67
Es la INTRODUCCIÓN de un fragmento de DNA denominado INSERTO dentro de una molécula denominada VECTOR, que puede replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la célula hospedera.
Los Vectores son moléculas que tienen la intención de llevar un ADN específico y que se pueda multiplicar, en algunos casos incluso expresar. Las bacterias tienen plasmidos que contienen genes de resistencia.
En que consiste la CLONACIÓN
Introducir inserto dentro de un vector.
68
Creación de librerías genómicas o genotecas: colección de fragmentos de ADN, provenientes de un organismo, clonados en vectores para facilitar su estudio.
Se pueden crear a partir de DNA o DNAc.
EJ: proyecto del genoma humano.
APLICACIONES de la CLONACIÓN
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VECTOR: molécula de ADN con capacidad de albergar un fragmento de ADN exógeno. Como Camiones que transportan genes.
Existen dos tipos: de clonación y de expresión.
La diferencia es la capacidad de ADN que pueden cargar.
VECTORES DE CLONACIÓN
70
Sirve para almacenar secuencias y obtener uun gran número de copias de l ADN insertado (plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos y cromosomas artificiales).
Plasmidos (segmentos cortos, provienen de bacterias), fagos y fagémidos (segmentos más largos, provienen de eucariontes), cromosomas artificiales.
VECTOR DE CLONACIÓN
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Sirven para producir un TRANSCRITO (ARN) o el PRODUCTO del transcrito, es deci, una PROTEÍNA (plásmidos o fagos).
Es decir, a partir de un ADN se obtiene una proteína. Organismos genéticamente modificados. En: insulina se inserta a E. Coli, se duplica, se transcribe, se traduce, organismo
VECTOR DE EXPRESIÓN
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- Origen de replicación (ORI)
- MARCADOR de selección: resistencia a antibióticos o generador de un fenotipo particular. (gen que da característica específica): gen de la beta galactosidasa (marcada con un florocromo) y cuando recibe el vector se tiñe de color azul.
- SITIO de clonación múltiple: sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para insertare el fragmento de DNA. Sitio donde pueda recibir al gen. Entre más grande es el vector, más complejo.
ELEMENTOS de los VECTORES de CLONACIÓN
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- PLÁSMIDOS (insertos pequeños aprox 5 kb)
- BACTERIÓFAGOS (hata 23 kb)
- CÓSMIDOS (hata 45 kb)
- CROMOSOMAS ARTIFICIALES (hasta 350 kb).
TIPOS de VECTORES de Clonación
74
Se emplean para PRODUCIR el TRANSCRITO del GEN insertado (RNAm) o para producir la PROTEÍNA que codifica.
Poseen: origen de replicación, sitio de clonación y marcador de selección, y ademas: sitio promotor para la transcripción, secuencia de término de la transcripción y poliadenilación, secuencia de unión al ribosoma (Shine-Dalgarno), codon de inicio de la traducción (AUG).
El vector se vuelve más complejo para que El huésped del vector pueda reconocer y así poder traducir, transcribir, etc.
VECTORES de EXPRESIÓN
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Técnica que permite la introducción de un DNA extraño en un organismo y consigue que se exprese como si fuese propio en millones de clonas moleculares.
Inserción de un DNA extraño en un vector de clonación para introducirlo en un organismo donde se producen procesos de recombinación y clonaje molecular resultando en la expresión del gen inducido.
TECNOLOGÍA del ADN RECOMBINANTE
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1. Preparacipon del inserto, digestión del ADN en posiciones precisas con endonucleasas de restricción.
2. Seleccionar una pequeña molécula de ADN capaz de autorreplicarse (vector de clonación). Si es corto, se puede escoger un plásmido.
3. Insertar los fragmentos obtenidos, proceso que hace naturalmente la ADN ligasa. Las moléculas de ADN que están compuestas de material genético de diferentes fuentes se denominan ADNs recombinantes. Es decir, Poner en contacto con una ADN ligasa y se genera un ADN recombinante.
4. Preparar células competentes (huesped)
5. Transformación: insertar los vectores de clonación a células específicas que contienen toda la maquinaria genetica para la expresión de la información contenida en el vector.
6. Seleccionar o identificar a las células que contienen al ADN recombinante.
PROCESO de CLONACIÓN de un segmento de ADN
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Ej: PBR 322, vector plásmido creado por Francisco Bolivar. En este se inserta el gen de insulina. El marcador es la resistencia a la ampicilina.
Primero el gen de insulina se inserta en la E. Coli. Para transformarla (inserción de un ADN extraño).
Ejemplo de tecnología de ADN recombinante
78
hacer a la célula competente, para eso se le pone cloruro de calcio (CaCl2) que rompe la estabilidad de la membrana citoplamática y que se vuelva más permeable para aplicar alguna fuerza y que se rompa o genere poros (agitación fuerte o electroforación). A través de los poros entre el vector. 6.- ocupar el sustrato marcador. Las bacterias que crezcan recibieron el vector. Se puede recuperar aquellas que recibieron el incierto y se conservan.
4. Preparar células competentes
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Consiste en introducir el vector de clonación ya con el INSERTO.
Transformación de las células
80
- Producción de PROTEÍNAS y HORMONAS: polimerasas, insulina, hormonas sexuales.
- Generación de PLANTAS TRANSGÉNICAS: Plantas con resistencia a ambientes extremos. que sean resistentes a las placas.
- Generación de animales transgénicos: ratones transgénicos que sobreexpresan la hormona del crecimiento. Organismos genéticamente modificados que se utilizan en la industria farmacéutica para estudiar la fisiología de la patología y el tratamiento.
- Producción de microorganismos transgénicos para bioremedación (biomarcadores): microorganismos que comen hidrocarburo.
Aplicaciones de Tecnología del ADN recombinante
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- Southern blot
- Nouthern blot
-
TÉCNICAS de HIBRIDACIÓN
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Esta técnica se utiliza para identificar un gen o una serio de genes en un DNA previamente extraido, mediante la unión por complementariedad.
Buscan identificar genes usando sondas (fragmentos de ADN que se producen a apartir de síntesis - PCR o por vectores de clonación - E Coli. Tiene un marcaje que puede ser radioactivo (cloroactivo, fluorocromo o quimiol).
Fragmentos de ADN que podemos visualizar fácilmente gracias al fósforo acoplado a fluorocromo O un compuesto luminicente. Se puede ver los fragmentos donde se colocó la sonda.
SOUTHERN BLOT
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1. Primero se extrae el DNA, se purifica y se digiere con enzimas de restricción.
2. Posteriormente se realiza una ELECTROFORESIS para SEPARAR los fragmentos según su tamaño y se tiñen para visualizar el patrón electroforético.
3. El DNA se DESNATURALIZA con una solución ALCALINA y los fragmentos del gel se TRANSFIEREN a una membrana de nitrocelulosa o nylon.
4. La membrana se somete a INCUBACIÓN con fragmentos de DNA diseñados y marcados con 32 o un fluorocromo para la identificación de un segmento de DNA específico (sondas).
Proceso de SOUTHERN BLOT
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- Medicina forense: para establecer la filiación de una persona o para obtener pruebas a partir de muestras mínimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos.
Aplicación de la Hibridación Southern Blot
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Se utiliza RNA. Debido al tamaño del RNA no es necesario utilizar enzimas de restricción, pero si se comparten los siguientes pasos: desnaturalización e hibridación con sondas marcadas.
Se usan Sondas radiactivas. Identifica si se está expresando de una menor o mayor cantidad, esto ayudaría a identificar si produciría patología.
Es una herramienta útil para estudiar los productos de TRANSCRIPCIÓN GÉNICA (ARNm) y su regulación.
HIBRIDACIÓN NORTHERN BLOT
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Se utiliza la hibridación del ADN o ARN drentro de un tejido sin los pasos de extracción o purificación del ácido nucleico.
Emplea bio molec (unión de sondas por complementaridad) e inmunohistoquímica (unión antígeno- anticuerpo).
Objetivo: identificación de componentes tisulares que puedan observarse al microscopio.
En inmunología se utiliza para las patologías qué hay antigeno-anticuerpo (infecciones). La sonda está marcada por un fluorocromo y se revelan los sitios de unión.
HIBRIDACIÓN IN SITU
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Una de las técnicas más empleadas es la utilización de FLUOROCROMOS para el MARCAJE de las SONDAS por lo que se conoce como Hibridación IN SITU acoplada a un sistema de fluorocromos (FISH).
FISH
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Las principales aplicaciones son los mapeos cromosómicos, la identificación de infecciones virales y el estuio de expresión de ciertos genes.
APLICACIONES de hibridación IN SITU
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mapeo cromosómico, se puede identificar donde se encuentra un patógeno o bacteria. . Se pueden identificar zonas especificas dentro del cromosoma o dentro de una célula. Se puede hacer directamente sobre el tejido, ahorra pasos.
Mapeo cromosómico
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La secuenciación del ADN consiste en dilucidar el orden de los nucleótidos de un polímero de ADN de cualquier longitud.
SECUENCIACIÓN
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Se utiliza dos tipo: -
1. Didesoxinucleótido (no hay hidróxido en la posición 2), están marcados con fluorocromos. Irán variando de tamaño según el lugar donde haya caído el didesoxirribonucleótido ya que ahí para el crecimiento. Los fragmentos más cortos migran más distancias, los más largos migran menos distancias. Se separa el carril y migra hacia La cromatografía capilar donde se revele que didesoxinucleótido terminal se encuentra. Al final se obtiene el cromatograma de la cromatografía que indica él tamaña o de la cadena y su identidad. Indica qué nucleotido corresponde a a cada posición. Las secuencias se suben a un banco de datos, el de EUA es GeneBank, pretenden almacenar las secuencias primarias de los ADN que se han estudiado (260 Mil especies aprox). Se puede Alinear (comparar) con las secuencias que están guardadas ahí e identificar las secuencias dañadas en nuestra muestra. Nos sirve para identificar proteínas dañadas.
TÉCNICA DE SANGER, SECUENCIACIÓN
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Identificar masivamente la expresión de proteinas , ARN...
| La tecnología de MICROARRAYS es una tecnología en desarrollo para estudiar la expresión de muchos genes a la vez.
MICROARREGLOS
| que es?
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Consiste en colocar miles de secuencias génicas en lugares determinados sobre un portaobjetos de vidrio llamado CHIP. Una muestra que contiene ADN o ARN se pone en contacto con el chip. El apareamiento de las bases complementarias entre la muestra y las secuencias de genes en el chip produce una cantidad de luz que se puede medir. Las áreas del chip que producen luz identifican los genes que se expresan en esa muestra.
MICROARREGLOS
| consiste en..
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3000 Millones de bases aprox 30,000 genes.
- 50% son secuencias repetitivas.
- Se desconoce la función del 50% de los genes.
- Menos del 2% es genoma codificante.
- Se han identificado más de 1400 genes reacionadas con enefermedades.
PROYECTO GENOMA HUMANO
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Identificación de las colonias transformadas
Depende del tipo de marcador del vector.
- Resistencia a antibióticos: ampicilina, tetraciclina, etc.
- Producción de moléculas: fluorescentes.
- Producción de enzimas que dan un color con cierto sustrato
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A partir del sitio de origen se sintetizan dos cadenas en ambos sentidos, con dos puntos de crecimeinto que forman una horquilla de replicación.
En EUCARIONTES: La replicación es multifocal (con múltiples ARS).
ORI: origen de replicación en procariontes.
ARS (autosonomously replicating sequences) origen de replicación en eucariontes (secuencias de replicación autosómica).
BIDIRECCIONAL
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Son puntos fijos, a partir de los cuales se lleva a cabo la replicación, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla.
La cantidad de DNA que se puede sintetizar a partir de un único origen de replicación se denomina REPLICON o UNIDAD FUNCIONAL de la REPLICACIÓN.
El genóma bacteriano es un replicón único circular.
En organismos eucarióticos, la replicación del DNA se inicia en múltiples orígenes a la vez (hay uno casa 20 kb aprox), es decir, hay multitud de replicones.
ORIGENES de REPLICACIÓN
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La replicación siempre se realiza en dirección 5´->3´y es en el extremo 3´-OH que ocurre la elongación.
Una de las cadenas (CADENA RETRASADA) se sintetiza por segmentos, llamado FRAGMENTOS DE OKAZAKI (100-400 nucleótidos).
DISCONTINUA
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Complejo enzimático que realiza la elongación de la nueva cadena de ADN.
REPLISOMA
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Disciplina que permitirá el empleo de las tecnologías de genética molecular para atender de forma individualizada a cada paciente, en base al conocimeinto de su genoma.
Parámetros de estudio:
- Variabilidad genética.
- Perfiles de expresión de los genes, proteínas y metabolitos.
MEDICINA GENÓMICA
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Estudios genéticos para el diagnóstico.
- Farmacogenómica.
- Nutrigenómica.
Aplicación en la investigación médica
Biología Molecular
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