3. TÉCNICAS DE FIJACIÓN Flashcards
(17 cards)
¿En qué consiste la fijación?
La fijación consiste en interrumpir los procesos degradativos de autolisis y putrefacción, para inmovilizar las estructuras celulares y tisulares en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Así, las muestras que llegan al laboratorio de anatomía patológica pueden venir fijadas o en fresco con suero fisiológico.
Los principios generales de las técnicas de fijación se recogen en:
- No existe un fijador universal; un fijador puede ser bueno para un tejido e inútil para otro.
- No todos los fijadores son conservantes, ya que fijación no equivale a conservación tisular.
- Un defecto de fijación nunca puede ser corregido.
- Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos de fijación.
El fijador ideal debe reunir las siguientes características:
a. Bloquear de inmediato la autolisis. Hay que tener en cuenta la velocidad de penetración y la velocidad de fijación.
b. Efecto microbicida. Impedir la acción de bacterias de la putrefacción.
c. No provocar sobre el tejido retracciones o distorsiones que determinen anomalías en su arquitectura. Esto ocurre cuando la presión osmótica del tejido es menor que la del fijador, entonces el agua tiende a fluir hacia el fijador por fenómenos de ósmosis, en caso contrario, si la presión osmótica del tejido es mayor, el agua fluye hacia el tejido provocando su hinchamiento. Por esto la presión osmótica del tejido y del fijador deben ser equivalentes.
d. Inducción de cambios en la textura y composición celular que favorezcan la inclusión, corte y coloración del material histológico.
3.2 CLASIFICACIÓN DE LOS FIJADORES
Existen varias formas de clasificar los fijadores. Según el tipo de estudio encontramos:
Fijación histológica o citológica. Se centra en la conservación del a arquitectura y estructura de los tejidos y células, sin considerar los cambios moleculares. Ejemplo: formol.
Fijación histoquímica. Prefiere preservar la composición molecular y bioquímica del os tejidos que conservar los detalles morfológicos celulares. En este caso es posible realizar estudios microscópicos que incluyen datos sobre el funcionalismo tisular (histoquímica enzimática) y su composición antigénica (inmunohistoquímica).
También se pueden clasificar según las fases del proceso de fijación:
Fijador primario. Es el que se añade inmediatamente sobre el tejido fresco.
Fijador secundario. A un tejido ya fijado le podemos añadir un segundo fijador para demostrar algún componente tisular específico, o bien para reforzar la acción del fijador primario.
Por último, según su mecanismo de acción encontramos:
Fijadores químicos. Son aquellos que actúan desnaturalizando las proteínas, lo cual bloquea la autolisis por inactivación enzimática. Además, algunos impiden el crecimiento microbiano. Se presentan generalmente en forma líquida y son los más usados.
Fijadores físicos. Son aquellos que emplean fundamentalmente la congelación para detener el deterioro tisular.
3.2.1 Fijación por métodos físicos
Es el método de elección para realizar estudios en los que se requiera conservar intacta la estructura antigénica del tejido o su contenido enzimático. Aunque existen otros métodos físicos de fijación, el más empleado es el de enfriamiento por congelación del tejido como método para detener la autolisis y putrefacción tisular.
¿Cuál es la clave de este método, método físico?
La clave radica en que su congelación sea instantánea: un enfriamiento lento provoca la formación de microcristales intratisulares de hielo susceptibles de provocar rotura tisular, lo cual dificulta el diagnóstico. Por ello, solo haremos la congelación en el criostato o en congelar si vamos a realizar los cortes histológicos de inmediato, como es el caso de las biopsias intraoperatorias.
Procedimiento idóneo y otros métodos de fijación física
El procedimiento idóneo para fijar por congelación consiste en utilizar isopentano -50ºC como agente de congelación y realizar una fragmentación suficiente de la pieza a congelar (bloques de no más de 3 cm3 u 3 mm de espesor) de modo que el proceso de congelación instantánea no requiera de más de 10 segundos.
Otros métodos son la criodesecación o liofilización, que consiste en someter el tejido a fijación instantánea por congelación en nitrógeno líquido, y desecación por sublimación del agua congelada.
3.2.2 Fijación por métodos químicos
¿Cómo actúan?
Los agentes fijadores, generalmente líquidos, actúan desnaturalizando e insolubilizando las proteínas tisulares, lo cual bloquea la autolisis por inactivación enzimática. Además, algunos líquidos fijadores impiden el crecimiento bacteriano, como es el caso del formol.
Existen una serie de reglas o normas a tener en cuenta en el uso de los líquidos fijadores y son:
- El tejido debe ser colocado cuanto antes en el fijador.
- El tejido debe estar seccionado en láminas de 0’5 cm de espesor máximo.
- La relación entre el volumen del fijador y el de la pieza debe ser de 20 a 1. Si no es posible será al menos de 5 a 1.
- La presión osmótica del fijador y del tejido deben ser similares.
- El pH del fijador debe ser similar al del tejido, salvo que en su composición deba contener ácidos.
- El tiempo de fijación es específico de cada fijador, pero existe un tiempo máximo que no debe ser sobrepasado.
- La pieza debe ser colocada sobre el fijador y no sobre el recipiente vacío, esto es para evitar adherencias a la pared del recipiente.
- Los recipientes serán de boca ancha y estarán perfectamente etiquetados.
Los líquidos fijadores se dividen en dos tipos,
los fijadores simples y las mezclas fijadoras.
Fijadores simples o puros
De todos los fijadores puros, sólo se utilizan aislados el formol, el alcohol y el ácido ósmico. El resto no se utilizan nunca aislados, pues las ventajas que estos suponen, se ven contrarrestadas por una serie de inconvenientes considerables.
Se pueden dividir en cuatro categorías:
Fijadores por deshidratación tisular. Actúan eliminando tanto el agua libre, como la ligada a las moléculas proteicas, de forma que estas precipitan. Este proceso es conocido por el nombre de desnaturalización y provoca importantes alteraciones en la estructura celular. Por tanto, la mayoría de estos agentes fijadores inducen grandes cambios en la morfología. Los principales agentes por deshidratación son los alcoholes (metílico y etílico), la acetona y el cloroformo.
Fijadores por cambios en el estado coloidal de las proteínas. Las soluciones coloidales precipitan en presencia de determinados ácidos, que disminuyen el pH de la disolución. Al cambiar el pH se frena la autolisis. Los fijadores de este tipo son de carácter ácido, se emplean formando parte de mezclas fijadoras y poseen gran velocidad de penetración de los tejidos. El ácido acético es el fijador más empleado, ideal para la fijación de nucleoproteínas y ácidos nucleicos. Otros fijadores son el ácido tricloroacético y el ácido crómico.
Fijadores que actúan por formación de sales con los tejidos. En este caso, el agente fijador es el catión metálico, fundamentalmente cromo o mercurio, o un derivado orgánico como el ácido pícrico. Los fijadores de este tipo poseen una gran velocidad de fijación, ya que la formación de la sal se produce simultáneamente. Sin embargo, produce un efecto barrera que dificultan la penetración del fijador. La precipitación metálica sobre el tejido provoca además un notable endurecimiento, lo que obliga a emplearlo en mezclas fijadoras que amortigüen este efecto.
Fijadores que actúan por reticularización de las proteínas. La reticularización consiste en la rotura de los puentes de hidrógeno de las proteínas por el fijador, formándose nuevos enlaces entre las proteínas, en los que interviene el fijador, de forma que se produce una malla reticular polipeptídica. Los más comunes son el formol o formaldehído, el glutaraldehído y el tetróxido de osmio.
Mezclas fijadoras
Tienen por finalidad compensar las desventajas que pueda presentar una sustancia fijadora con las ventajas de otra. Algunas de ellas se utilizan para fijar de manera especial un componente celular y otras sirven para un problema determinado. Se clasifican en dos grupos, según tengan o no formol en su composición:
Mezcla fijadora con formol
- Líquido de Bouin. Se emplea como alternativa a la formalina cuando no se desea emplear el sublimado debido al endurecimiento que produce, sobre todo en ciertos tejidos como la piel, glándulas endocrinas, testículos, etc. No está indicado en biopsias renales. Terminada la fijación de las piezas, se lavan con alcohol de 70/80º hasta la desaparición de su coloración amarillenta.
- Bouin alcohólico. Es una alternativa al líquido de Bouin cuando la pieza a fijar es voluminosa y cuando necesitamos fijar selectivamente el glucógeno.
- Líquido de Gendre. Es una variante de Bouin alcohólico especialmente indicada para la fijación de glucógeno y pigmentos hemoglobínicos.
En cuanto a las que no contienen formol encontramos:
- Líquido de Zenker. Se usa como segundo fijador en el proceso de refijación y decalcificación a que son sometidas las biopsias de médula ósea cuando se realiza fijación inicial con B-5. Se compone de la solución sotck de Zenker a la que se le añade en el momento de su uso ácido acético glacial.
- Líquido de Carnoy. Es el mejor fijador para el glucógeno, y en general para hidratos de carbono simples y proteínas fibrilares. Es un fijador muy rápido. Se compone de etanol, cloroformo y ácido acético.
