Cryotomie et immunohistochimie

Question 1

Pourquoi congeler?

Answer 1

Plus rapide
Bx urgentes
Mide en évidence des lipides (best méthode)
Techniques en fluorescence (démonstration Ac): dermatologie (gèle, met sur lame, freezer, attend pour batch)

Question 2

C’est quoi un cryotome?

Answer 2

Cryostat

Chambre réfrigérée contenant un microtome habituellement de type rotatif

Question 3

Méthodes courantes

Answer 3

1. azote liquide

2. OCT (optimum cutting temperature)

Question 4

Azote liquide

Answer 4

4 secondes
Tissus mous craquent (expansion trop rapide)
Doit laisser tissu équilibrer à la temp. du cryostat sinon dommages bloc et couteau
Difficile a congeler tissu également (vapeur autour tissu isole)
Rarement utilisé seul –> souvent utilise isopentane en premier

Question 5

OCT

Answer 5

Un produit chimique
Souvent utilisé dans labs d’histo
Pas tjrs besoin d’utiliser azote
Peut être utilisé seul

Question 6

Effets de la congélation

Answer 6

1. congélation lente: cristaux de glace de grosseur prop. à vitesse de congélation –> font des trous dans le tissu
2. congélation rapide: craquage des tissus
3. tissu trop froid: tissu tendance à pulvériser ou désagréger lors de la coupe

Question 7

La coupe

Answer 7

Sections ramassées directement sur lame
Lame gardée TP alors va coller coupe
RT*** plaque anti-roulement permet d’empêcher la coupe de rouler sur elle-même –> doit être bien ajustée par rapport au couteau
Temp. interne du cryostat maintenue -20 oC

Question 8

Coupes plus chaudes

Answer 8

Cerveau
Foie
Rate
Nodules lymphoides
Matériel endométrial

Question 9

Couples plus froides

Answer 9

Tissu avec gras

Question 10

Coloration

Answer 10

Ish la même que pour tissus fixés dans formol
H&E rapide avec étape rapide de fixation au tout début
Ne fait jamais de colo spéciales

Question 11

Comment désinfecter

Answer 11

Vapeurs de formaldéhydes
Glutaraldéhydes 2%
Solution phénol 5%
Alcool absolu
Solutions commerciales de plus en plus utilisées (virox)

Question 12

Maintenance du cryostat

Answer 12

Usually les vendredis fin de day –> comment souvent dépend du lab
1. décongèle
2. nettoyer
3. lubrifier (huile spéciale pour basses Temp.)
Cryostat doit être complètement asseché avant lubrification et avant de recongeler
Entre chaque Pt doit seulement enleber débrit de tissu avec gaz temp. piece (va coller dessus)

Question 13

Troubleshooting: mécanisme devient raide

Answer 13

Souvent cuz eau/humidité

Traite avec alcool 100%, sèche, lubrifie de nouveau

Question 14

Troubleshooting: tissu se fragmente

Answer 14

Temp. trop basse usually

Question 15

Troubleshooting: tissu s’accumule sur bord de lame

Answer 15

Souvent cuz temp. trop huate (colle sur lame)

Question 16

Angle du couteau

Answer 16

30 oC

Question 17

Entreposage des tissus congelés

Answer 17

Enveloppe pour empêcher le contact avec l’air et sont mis à -70 oC sinon deshydratation
Fixer et traiter pour faire d’autres coupes avec colo spéciales ou tests d’immunohistochimie

Question 18

Immunohistochimie: info générale

Answer 18

Remplace de plus en plus les colo spéciales –> Ac plus spécifiques –> colo spéciales peuvent s’attacher à d’autre endroits (moins spécifique)
Ag: structure recherchée
Ac: réactif
Complexe Ac-Ag invisible de nature so use Ac couplé à autre molécule qui est spontanément colorée ou devient aisément
Autre molécule usually fluorochromes (spontanément fluorescents) ou peroxydase (donne secondairement avec la para-aminobenzidine un précipité brun foncé)
Peut aussi utiliser anti-sérum pour amplifier signal (ex: avidine-biotine-peroxydase)
Ac coutent cher

Question 19

Point technique à considerer pour immunofluorescence

Answer 19

Sections prep par congélation (diminue moins l’activité Ag et la colo est plus intense)
Ag solubles sont perdus
Fixation dans formaldéhyde rarement utilisée cuz le procédé et circulation subséquente endommage la réactivité Ag

Question 20

Points techniques: déshydratation et fixation par agents chimiques

Answer 20

Déshydratation déplie et change la solubilité des PR-
Fixation chimique dénature et stabilise PR- soit par coag, formation de composés additifs ou par combinaison des 2
Fixateurs coagulants et non additifs permettent une bonne pénétration de Ac et ne bloquent pas les déterminants immunoréactifs (use formol pareil)
Doit fixer puisque Ag = PR- (soluble en solution aqueuse)

Question 21

Quand la congélation necessaire?

Answer 21

Plusieurs Ag (surtout marqueur GB de surface) ne survivent pas au traitement paraffine ou fixation avec agents chimiques additifs

Question 22

Vimentine

Answer 22

Situé surtout dans le tissu conjonctif (fibroblastes, macrophages, Sertoli, mélanocyte, lymphs, podocytes)
Présence indique sarcome musculaire
Ag facilement détruit
Formaline détruit –> alcool préférable
CQ de fixation
Si trop fixé, vimentine sera moins intense
Si juste right devrait still avoir vimentine

Question 23

Fixateurs: acétone et alcool

Answer 23

coag

non additif

Question 24

Fixateurs: formaldéhyde

Answer 24

non coag, additif
8-12h fixation –> 24h max
Liens qui cachent les sites Ag
Méthode de récupération des épitopes so moins besoin de watcher le temps dans le fixateur
Formaldéhyde-zinc: préserve mieux réactivité immuno

Question 25

Fixateurs: chlorure mercurique

Answer 25

coag, additif | B5

Question 26

B5

Answer 26

Bon pour démonstration Ag intracytoplasmiques Bx de ganglions lymphatiques pour meilleure préservation des détails cytologiques et augmentation de la réactivité immunologique Ig de surface membranaires sont moins bien démontrées Pas bon pour Ag non lymphoide: colo de fond, artéfact cytoplasmique (dans cellules tumorales) Ne peut pas utiliser pour fixation tumeurs origine inconnue

Question 27

Fixateurs: bouin

Answer 27

Bonne préservation Ag

Question 28

Fixateurs: Zenker

Answer 28

Bonne préservation Ag

Question 29

Méthanol-Carnoy

Answer 29

Fixateur base alcool | Bonne préservation Ag

Question 30

Glutaraldéhyde

Answer 30

à éviter préserve bien morpho tissulaire bloque déterminants Ag de façon irréversible

Question 31

Circulation

Answer 31

Fixation doit être complète | Paraffine dommage Ag (bas point d'ébulition)

Question 32

Microtomie

Answer 32

Eau distillée propre seulement Pas d'adhésif ou de substance ajoutée au bain Port de gants (particules de peau) Pas de plis dans le tissu --> provoque artéfacts

Question 33

Récupération des Ag

Answer 33

Quand use formol par exemple (excès de liaisons interPR-) --> Ac n'ont pas accès --> faux négatifs 2 méthodes: chaleur et aux Z (livre p.282)

Question 34

Avantages de récupération

Answer 34

1. peut plus diluer Ac (coutent cher) 2. peut détecter Ag usually non détectables 3. Rxn plus intense avec temps incubation plus court 4. colo plus uniforme 5. colo de fond diminuée 6. consistance des colo (répétables) 7. meilleure standardisation

Question 35

Méthode de visualisation: immunofluorescence

Answer 35

Ac conjugué à un fluorochrome (fluoroscéine --> vert, rhodamine --> rouge/orange) Combine sensibilité, spécificité et simplicité Surtout pour Bx de peau et rein (coupes par congélation préférable)

Question 36

Méthode de visualisation: immunoperoxydase (immunohistochimie enzymatique)

Answer 36

+ d'étapes que immunofluo Principle similaire Ac couplé avec Z Z + substrat + chromogène = système qui permet de visualiser localisation Ac sur tissu --> développement d'une couleur

Question 37

immunoperoxydase: types d'Z

Answer 37

1. Phosphatase alcaline 2. Bêta galactosidase 3. Glucose oxydase 4. Peroxydase de radis fort

Question 38

immunoperoxydase: chromogène

Answer 38

Donneur d'électrons Produit une colo suite à oxydation 2 sortes: DAB et AEC

Question 39

DAB

Answer 39

Insoluble dans alcool et xylol (xylène) --> souvent pour ca qu'on utilise Brun SUPER cancérigène

Question 40

AEC

Answer 40

Soluble dans alcool (utilisé seulement un milieu de montage aqueux) Colo rouge Cancérigène

Question 41

Méthode directe

Answer 41

Ac spécificité connue pour ID Ag dans tissu Ac couplé à fluorochrome Ac conjugué mis en contact avec section de tissu Complexe Ag-Ac si Ag présent Surtout pour spécimens de peau et rein Immunofluorescence = méthode directe Fluorochromes: fluoroscéine (vert) et rhodamine (orangé-rouge)

Question 42

Méthode directe: avantages

Answer 42

Rapide Easy Sections 2 microns préférables, mais 5-6 workent Méthode de choix pour détection Ig sur coupe de peau

Question 43

Méthode directe: désavantages

Answer 43

``` Besoin de sections congelées Microscope fluo usually necessaire Pas très sensible Auto-fluo des ac. nucléiques = problème Preparations pas permanentes (doit garder dans endroit frais et sombre ```

Question 44

Méthode indirecte

Answer 44

+ spécifiques que méthode directe Voir photos p. 231 pour visualiser 1er Ac: spécifique à l'Ag 2em Ac: spécifique au 1er Ac et couplé à un marqueur Méthode de visualisation usually immunofluorescence

Question 45

Méthode indirecte utilisée dans 2 cas suivants

Answer 45

1. Ac antinucléaires Sérum Pt ajouté aux sections de tissus contenant Ag connu pour déterminer si le Pt possède Ac Ac marqué (Ig anti-humain) utilisé pour détecter Ac du Pt qui serait fixé 2. Tout simplement any situation que tu use 2 ou 3 Ac pour détecter l'Ag dans le tissu

Question 46

2 types de méthode indirecte

Answer 46

1. 2 étapes - 1er Ac --> non-marqué, mais spécifique à Ag - 2em Ac --> marqué et dirigé contre 1er Ac 2. 3 étapes - 1er Ac --> non-marqué, mais spécifique à Ag - 2em et 3em Ac --> marqués et dirigés contre 1er et 2em Ac - intensifie couleur - méthode 2X plus longue

Question 47

Méthode du complexe immun enzymatique soluble | p. 284

Answer 47

3 étapes: 1. 1er Ac --> lie Ag du tissu, provient du lapin 2. 2em Ac (AKA Ac de liaison) --> lie 1er Ac, provient de souris 3. Complexe Z-antiZ --> lie 2em Ac, provient de lapin 2em Ac fait lien entre 1er Ac et complexe Z-antiZ --> 1er Ac et complexe Z-antiZ doivent alors venir du même animal (pour que liaison se fasse) Ajoute ensuite substrat pour développer colo (faire réagir les Z) Méthodes plus communes: 1. PAP --> peroxydase- antiperoxidase 2. Phosphatase alcaline - antiphosphatase alcaline

Question 48

Méthode Avidine-Biotine (Avidin-Biotin Complex ou ABC)

Answer 48

2 méthodes: ABC (plus fréquente) et LAB (labeled Avidin-Biotin) Voir p. 233 pour visualiser (photo à gauche est ca décrit dans la procédure but chepas cos qu'est la photo à droite... méthode LAB maybe?)

Question 49

Avidine

Answer 49

PR- 4 sous-unités --> chaqu'un possède 1 site de liaison Source: blanc d'oeuf (contient partie d'hydrate de carbone) ou streptomycetes Très grande affinité pour vitamine biotine (about 1 million de fois plus fort que affinité d'un Ac pour son Ag)

Question 50

Biotine

Answer 50

Vitamine Dans jaune d'oeuf Forte affinité pour avidine

Question 51

3 réactifs

Answer 51

1. 1er Ac --> lie Ac recherché --> très spécifique 2. 2em Ac conjugué à biotine --> peut lier 1er Ac et complexe ABC 3. Complexe ABC --> molécule avidine et biotine: contient des sites libres pour la biotine since avidine peut lier 4 molécules de biotine --> molécule ABC liée à un Z

Question 52

Procédure ABC

Answer 52

1. déparaffinage, éclaircissement, hydratation 2. Traitement lames avec H2O2 + méthanol: bloque activité endogène de peroxydase dans les tissus --> surtout tissus avec bcp de sang 3. Solution protéique de bloquage (universal blocker): blocage/remplis des sites chargées (collagène et conjonctif) --> ne veut pas que Ac fixe --> doit venir du même animal que 2em Ac pour éviter que 2em Ac fixe solution protéique (sinon: bruit de fond, colo non spécifique) 4. 1er Ac 5. incubation et lavage 6. 2em Ac 7. incubation et lavage 8. Réactif ABC: complexe avidine-biotine couplé à Z (peroxydase) 9. incubation et lavage 10. DAB: formation d'un composé coloré 11. incubation et lavage 12. contre-colo: hématoxyline de Mayer (pas d'alcool)