Cryotomie et immunohistochimie Flashcards Preview

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Flashcards in Cryotomie et immunohistochimie Deck (52)
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1

Pourquoi congeler?

Plus rapide
Bx urgentes
Mide en évidence des lipides (best méthode)
Techniques en fluorescence (démonstration Ac): dermatologie (gèle, met sur lame, freezer, attend pour batch)

2

C'est quoi un cryotome?

Cryostat
Chambre réfrigérée contenant un microtome habituellement de type rotatif

3

Méthodes courantes

1. azote liquide
2. OCT (optimum cutting temperature)

4

Azote liquide

4 secondes
Tissus mous craquent (expansion trop rapide)
Doit laisser tissu équilibrer à la temp. du cryostat sinon dommages bloc et couteau
Difficile a congeler tissu également (vapeur autour tissu isole)
Rarement utilisé seul --> souvent utilise isopentane en premier

5

OCT

Un produit chimique
Souvent utilisé dans labs d'histo
Pas tjrs besoin d'utiliser azote
Peut être utilisé seul

6

Effets de la congélation

1. congélation lente: cristaux de glace de grosseur prop. à vitesse de congélation --> font des trous dans le tissu
2. congélation rapide: craquage des tissus
3. tissu trop froid: tissu tendance à pulvériser ou désagréger lors de la coupe

7

La coupe

Sections ramassées directement sur lame
Lame gardée TP alors va coller coupe
RT*** plaque anti-roulement permet d'empêcher la coupe de rouler sur elle-même --> doit être bien ajustée par rapport au couteau
Temp. interne du cryostat maintenue -20 oC

8

Coupes plus chaudes

Cerveau
Foie
Rate
Nodules lymphoides
Matériel endométrial

9

Couples plus froides

Tissu avec gras

10

Coloration

Ish la même que pour tissus fixés dans formol
H&E rapide avec étape rapide de fixation au tout début
Ne fait jamais de colo spéciales

11

Comment désinfecter

Vapeurs de formaldéhydes
Glutaraldéhydes 2%
Solution phénol 5%
Alcool absolu
Solutions commerciales de plus en plus utilisées (virox)

12

Maintenance du cryostat

Usually les vendredis fin de day --> comment souvent dépend du lab
1. décongèle
2. nettoyer
3. lubrifier (huile spéciale pour basses Temp.)
Cryostat doit être complètement asseché avant lubrification et avant de recongeler
Entre chaque Pt doit seulement enleber débrit de tissu avec gaz temp. piece (va coller dessus)

13

Troubleshooting: mécanisme devient raide

Souvent cuz eau/humidité
Traite avec alcool 100%, sèche, lubrifie de nouveau

14

Troubleshooting: tissu se fragmente

Temp. trop basse usually

15

Troubleshooting: tissu s'accumule sur bord de lame

Souvent cuz temp. trop huate (colle sur lame)

16

Angle du couteau

30 oC

17

Entreposage des tissus congelés

Enveloppe pour empêcher le contact avec l'air et sont mis à -70 oC sinon deshydratation
Fixer et traiter pour faire d'autres coupes avec colo spéciales ou tests d'immunohistochimie

18

Immunohistochimie: info générale

Remplace de plus en plus les colo spéciales --> Ac plus spécifiques --> colo spéciales peuvent s'attacher à d'autre endroits (moins spécifique)
Ag: structure recherchée
Ac: réactif
Complexe Ac-Ag invisible de nature so use Ac couplé à autre molécule qui est spontanément colorée ou devient aisément
Autre molécule usually fluorochromes (spontanément fluorescents) ou peroxydase (donne secondairement avec la para-aminobenzidine un précipité brun foncé)
Peut aussi utiliser anti-sérum pour amplifier signal (ex: avidine-biotine-peroxydase)
Ac coutent cher

19

Point technique à considerer pour immunofluorescence

Sections prep par congélation (diminue moins l'activité Ag et la colo est plus intense)
Ag solubles sont perdus
Fixation dans formaldéhyde rarement utilisée cuz le procédé et circulation subséquente endommage la réactivité Ag

20

Points techniques: déshydratation et fixation par agents chimiques

Déshydratation déplie et change la solubilité des PR-
Fixation chimique dénature et stabilise PR- soit par coag, formation de composés additifs ou par combinaison des 2
Fixateurs coagulants et non additifs permettent une bonne pénétration de Ac et ne bloquent pas les déterminants immunoréactifs (use formol pareil)
Doit fixer puisque Ag = PR- (soluble en solution aqueuse)

21

Quand la congélation necessaire?

Plusieurs Ag (surtout marqueur GB de surface) ne survivent pas au traitement paraffine ou fixation avec agents chimiques additifs

22

Vimentine

Situé surtout dans le tissu conjonctif (fibroblastes, macrophages, Sertoli, mélanocyte, lymphs, podocytes)
Présence indique sarcome musculaire
Ag facilement détruit
Formaline détruit --> alcool préférable
CQ de fixation
Si trop fixé, vimentine sera moins intense
Si juste right devrait still avoir vimentine

23

Fixateurs: acétone et alcool

coag
non additif

24

Fixateurs: formaldéhyde

non coag, additif
8-12h fixation --> 24h max
Liens qui cachent les sites Ag
Méthode de récupération des épitopes so moins besoin de watcher le temps dans le fixateur
Formaldéhyde-zinc: préserve mieux réactivité immuno

25

Fixateurs: chlorure mercurique

coag, additif
B5

26

B5

Bon pour démonstration Ag intracytoplasmiques
Bx de ganglions lymphatiques pour meilleure préservation des détails cytologiques et augmentation de la réactivité immunologique
Ig de surface membranaires sont moins bien démontrées
Pas bon pour Ag non lymphoide: colo de fond, artéfact cytoplasmique (dans cellules tumorales)
Ne peut pas utiliser pour fixation tumeurs origine inconnue

27

Fixateurs: bouin

Bonne préservation Ag

28

Fixateurs: Zenker

Bonne préservation Ag

29

Méthanol-Carnoy

Fixateur base alcool
Bonne préservation Ag

30

Glutaraldéhyde

à éviter
préserve bien morpho tissulaire
bloque déterminants Ag de façon irréversible