DNA sequencing technologies Flashcards
(22 cards)
Genomgrößen von Viren, Bakterien, Menschen
Virus-Genom -> 3000 bp
Bakterien-Genom ->3 Mio bp
Menschen-Genom -> 3 Mrd bp
Genomgröße und Komplexität korrelieren nur wenig
- > manche Bakterien haben größere Genome als Eukaryoten
- > Manche Pflanzen und Insekten haben größere Genome und mehr Chromosomen als viele Säugetiere
Sequenase
- T7 DNA Polymerase
- niedrigere ddNTP Konzentration benötigt als bei anderen DNA Polymerasen (less discrimination)
Problem: Starke 3’-5’-exonuclease Aktivität –> entfernt Nukleotide vom Ende der Polynukleotid Kette
Griffith Experiment (1928)
- Lebende glatte S-Zellen besitzen eine Kapsel und töten Mäuse (Immunzellen können Bakterien mit Kapseln nicht töten)! –> Lungenentzündung
- Raue R-Zellen ohne Kapsel sind nicht pathogen
- -> Kombination aus lebenden R- & toten S-Zellen tötet Mäuse
- –> DNA für Kapselbildung wird aus toten S-Zellen freigesetzt und von R-Zellen aufgenommen, die dann zu S-Typ-Zellen transformiert werden
TRANSFORMATION
Sanger Sequenzierung
- radioaktiv markierter Primer (32P) bindet an den einzelsträngigen template DNA Strang
- DNA-Polymerase verlängert den komplementären DNA Strang durch den Einbau von dNTPs
- parallel in 4 Reaktionsgemischen, in jedem Tube ist zusätzlich eine geringe Menge von ddNTPs einer Nukleotidsorte –> didesoxynukleotidtriphosphate ohne 3’-Hydroxylgruppe
- Einbau eines ddNTPs führt zu Kettenabbruch
- Die Reaktionsprodukte werden per Gelelektrophorese der länge nach aufgetrennt
- -> Das jeweils letzte NTP der Kette ist bekannt und somit kann die Nukleotidsequenz bestimmt werden
Pyrosequenzierung
- Ausgehend von einem Primer wird der Komplementärestrang zu einer ssDNA Template verlängert
- Bei Einbau der korrekten komplementären Base wird ein Pyrophosphat (PPi) freigesetzt
- PPi wird von ATP Sulfurylase zu ATP umgesetzt
- -> Katalysiert von Luciferase reagiert das ATP mit Luciferin und Sauerstoff. Bei dieser Reaktion entsteht ein messbares Lichtsignal
- die Basen werden immer Abwechelnd dazugegeben und Lichtsignale werden gemessen
- der Unterschied in der Intensität des Lichtsignals ist für bis zu 4 gleichen dNTPs erkennbar
- Solid phase: DNA template wurde immobilisiert und nach jedem dNTP wird gewaschen
- Liquid Phase: DNA Template und Enzyme befinden sich in einer Picotiterplatte, nach der Reaktion werden dNTPs und ATP von Apyrase abgebaut bevor das nächste sNTP hinzugefügt wird
454-Sequenzierung
OneFragment=OneBead=OneRead
- DNA Fragmente werden mit kurzen Adaptern (A + B) am 5’ und 3’ Ende versehen und auf magnetischen, streptavidin überzogenen beads immobilisiert
- durch emPCR werden die jeweiligen DNA Fragmente auf dem Beads amplifiziert
- DNA positive Beads werden in Wells einer Picotiterplatte gegeben und mit Enzym beads
- dNTPs fließen über die Platte
- > Pyrosequencing
- 100 000 beads mit je millionenfachen Kopien ihres Fragments werden gleichzeitig sequenziert
Plus und Minus Sequenzierungsmethode (1975 Sanger)
- Ausgehend von einem Primer werden unterschiedlich lange ssDNA Fragmente kopiert (32P gelabled)
- 8 unterschiedliche Reaktionsgemische:
- – 4 mit je nur einer Sorte dNTP (+N)
- – 4 in denen je eine Sorte dNTP fehlt (-N)
- plus Reaktion bricht bei jedem anderen dNTP als dem in der Reaktionsmischung ab
- minus Reaktion bricht ab, wenn es an die Position des fehlenden Nukleotids gelangt
- 8 mixturen werden mit Gelelektrophorese aufgetrennt –> Reaktionsabbruch und damit die Nukleotidfolge kann ermittelt werden
Maxam und Gilbert Sequenzierung
32P gelabelte ssDNA wird chemisch basenspezifisch geschnitten
- > A+G, G, C+T, C sind Schnittstellen
- Gelelektrophorese trennt Fragmente nach Länge
WGS
Whole Genom Shotgun Sequencing
- DNA wird (zufällig) fragmentiert
- Die Fragmente (reads) werden von beiden Seiten sequenziert
- Überlappungen werden (bioinformatisch) festgestellt und contigs gebildet
- Problematisch: repeats
Contigs
Überlappende DNA Sequenzen (reads)
Clone by clone Sequencing
- Das Genom wird mit Restriktionsenzymen in überlappende Sequenzen geschnitten
- Eine physikalische Karte (physical map) der Fragmente wird erstellt
- Jeder Klon wird einzeln shotgun-sequenziert
–> Clone library erstellung nimmt sehr viel Zeit in Anspruch (Kohara lambda Klone für E.coli, YAC library für B. subtilis)
Draft sequencing
95% coverage
Reihenfolge der Contigs unklar -> gaps
günstiger
Fold Coverage
Anzahl der reads für eine bestimmte position
Illumina (Solexa)
- reversible terminator based sequencing
-DNA wird fragmentiert und auf beiden Seiten werden Adapter angebracht - DNA Fragmente werden auf der Oberfläche der Flow cell angebracht
- Bridge amplification
(- only forward strand) - Primer werden annealed
- fluoreszenzmarkierte dNTPs mit reversible terminator werden eingebaut (immer nur ein dNTP)
-nach detection des fluoreszenzsignals wird der terminator entfernt und das nächste markierte ddNTP wird eingebaut
True single molecule sequencing (tSMS)
Exonuclease Sequenzierung:
- transkript mit fluoreszierenden nukleotiden
- exonuklease schneidet die Basen nacheinander einzeln ab
- mit single molecule fluoreszenz spektroskopie wird die fluoreszenz für jede einzelne base gemessen und somit die sequenz bestimmt
Sequencing by Synthesis (SBS):
- Gelabelte Basen werden eingebaut und das fluoreszenz signal gemessen
- Das label wird entfernt/ fluoreszenz ausgeblichen bevor ein weiteres enukleotid eingebaut wird
-> Helicos:
- DNA single molecule templates sind auf einer flow cell befestigt
- eine Sorte Nukleotide mit Cy-5 gelabelt wird hinzugegeben
Nicht gebundene nukleotide werden weggewaschen
- image -> Cy-5 signal
- Cy-5 label wird entfernt
-nächste nukleotidsorte wird hinzugegeben
SMRT sequencing
Single Molecule Real Time Sequencing
- Einzelnes DNA Polymerase Molekül wird aus einem zero-mode waveguide chip befestingt
- ein einzelnen DNA molekül als template
- Nukleotide sind unterschiedlich fluoreszenz gelabled (phospho linked)
- > Wenn ein Nukleotid eingebaut wird wird das lable abgeschnitten und emmitiert Licht in einer bestimmten Farbe
- Emmision wird gemessen
Nanopore sequencing
- misst die Spannungsveränderung beim Transport der DNA über eine Membran durch eine Nanopore
- Ionenstrom
- picoAmpere Änderung ist Basenspezifisch
Genome annotation
Codierende Sequenzen und die Lage einzelner Gene im Genom werden bestimmt (Anhand von Referenz Genomen)
Pathogenitätsinsel
- Eine Pathogenitätsinsel ist eine zusammenhängende DNA-Sequenz mehrerer Gene im Genom eines Krankheitserregers (z. B. bei Bakterien), welche Virulenzfaktoren codieren
- Werden über horitzontalen Gentransfer übertragen
Staphylococcus aureus
Human-pathogen
- Gram+ Kokken
- Low-GC Firmicutes
- Erregervon Wundinfektionen, Abzessen, Endokarditis, Sepsis, Osteomyelitis
Horitzontaler Gen Transfer
Übertragung von genetischem Material zwischen zwei Organismen
- Transformation: Übertragung von genetischer Information durch Aufnahme freier DNA
- Transduktion: Gentransfer durch Viren
- Konjugation: Übertragung von DNA durch direkten Zellkontakt
Bakteriophagen
1) Adsorption an der Wirtszelle
2) Die Nukleinsäure gelangt über Penetration/Injektion in das Cytoplasma des Wirtes
3) Das virale Genom wird in der Wirtszelle exprimiert und repliziert, dabei wird auch eine neue Kapsel synthetisiert
4) Die Nukleinsäure kommt in die Kapsel und der fertige Virus wird wieder freigesetzt
