Transcriptomics Flashcards
(25 cards)
Gen: Monocistronic transcript
One gene has one promoter
Operon: Polycistronic operon
Several Genes have one promoter
-> multiple ORFs
Transcription elements
Promoter
Transcription start site (TSS)
Terminator
Translation elements
ORF - Open Reading Frame
RBS - Ribosome ninding site (Shine-Dalgarno-Sequence)
Regulons
Gene und Operons, die von einem gemeinsamen Transkriptionsregulatoren kontrolliert werden
Northern blotting
- ein denaturierte RNA wird durch Gelelektrophorese nach der Größe aufgeteilt und auf eine Membran gegeben
- Ein gelabletes DNA Fragment dient als Sonde um bestimmte Transkripte in der DNA zu finden und zu quantifizieren
S1 nuclease protection analysis
- 5’ gelabelte DNA-mRNA Hybride werden durch zugabe von antisense-Strängen als Sonde gebildet, diese gehen über den Transkriptionsstartpunkt
- S1 Nuklease baut doe ssRNA ab
Primer extension mapping (RTase)
- ein Primer bindet an der mRNA
- mithilfe von reverse Transkriptase wird eine cDNA kopie des 5’Endes der mRNA markiert, welches auch den Transkriptionsstartpunkt umfasst
- Der transkriptionsstartpunkt und die expression kann mit Gelelektrophorese bestimmt werden
Transcriptomics methods
- High density filters (macroarrays)
- Glass slides (microarrays)
- Affimetrics chips
(11)
Macroarrays
Complete mRNA –> cDNA –> Hybridize to Nylon Membrane (with spots of known DNA sequences)–> Image with Phosphoimager –> Overlay two images using False Colors
-1 condition per membrane
-good for small numbers of genes
-arrays reused several times
-requires larger volumes than microarrays
(12)
Microarrays
- higher spot (spots: known DNA sequences of genes) density than nylon membranes
- co-hybridized with two sets of cDNAS (2 conditions) labeled with different fluorescent dyes
- synthesized by microarraying robots
(16)
DNA microarray analysis - basic points
- DNA spots sind Sonden - PCR produkte oder oligonukleotide
- Target: Gelabelte cDNA die aus der mRNA erstellt wurde
–> Reverse transcriptase katalysiert die Synthese von Cy-gelebelter cDNA aus mRNA samples
-> Cy3 oder Cy5 gelabelte dNTPs werden eingebaut
–> als primer für die cDNA Synthese dienen zufällige Hexamere
-cDNA der Cy3-gelabelten Kontrolle und der Cy5-gelabelten test sample mRNAs werden auf einem microarray cohybridisiert
(21)
Experimental design microarrays
Normalization: per spot und per chip
Reciprocal labelling: Cy3 wird besser eingebaut als Cy5
Replicates: wegen experimenteller und/oder biologischer Variation der Daten
(23)
Example experiments (microarrays)
1) Comparative Transcriptomics
-WT vs. mutant
-one condition(stress) vs another (control)
2) Temporal (time series) analysis: e.g. nutrient starvation
3)’ChIP-on-chip’
- Transcription factor binding assay
- chromatin immunoprecipitation followed by microarray detection
(24)
“Omics”
Genomics: DNA
Transcriptomics: mRNA
Proteomics: Proteine
Metabolomics: Metabolite
Konventionelle Methoden zur Analyse von Gen Transkription
- -> one gene at a time
- Northern Blotting
- S1 Nuklease protection assay
- Primer extension mapping
Methoden der Transcriptomics zur Analyse von Gentranskription
- -> all genes at a time
- Macroarrays (High density filters)
- Microassays (Glass slides)
- Affimetrics chips
Chromatin-immunoprecipitation (ChIP)
- bestehende Protein-DNA Bindungen werden durch Formaldehyd fixiert
- die Zelle wird lysiert und das Chromatin zerstückelt
- ein antikörper bindet spezifisch an das gewünschte Protein –> Immunopräzipitation (isolierung)
- > DNA wird wieder abgetrennt und kann weiter analysiert werden
Synthese von Affymetrics Gen Chips
- Quartzmikroplättchen werden silanisiert -> hydroxylgruppen
- hydroxylgruppen werden blockiert
- Eine maske mit definierten Lücken wird aufgelegt
- Die linker von den beleuchteten stellen werden durch OH Gruppen ersetzt
- Eine Sorte Nukleotide wird dazugegeben und kann nur an den Stellen mit OH-Gruppen binden
- andere maske wird aufgelegt usw, 25 Nukleotide
- Probe pair: Perfect match und Missmatch (eine base anders), 11-20 Probe PAirs per Probe set
- Detect signals by staining with a) Streptavidin b) Anti-streptavidin antibody multiply labelled with biotin c) Streptavidin-phycoerythrin fluorescent conjugate (amplifies the signal).
NimbleGen High-density DNA arrays
- Maskless Array Synthesiser (MAS) –> produziert high density DNA-arrays ohne Maske
- -> Digital Micromirror Device (DMD) ist ein miniatur Spiegel, der UV-licht reflektiert um virtuelle masken zu erstellen
Transcriptomics Datenanalyse
- Jedes Microarray generiert tausende Datenpunkte
- Signalintensität für jedes Gen wird in beiden Kanälen gemessen
- Durchschnitt für Replikate muss berechnet werden
- Betroffene Gene müssen identifiziert werden
- Signifikante Effekte müssen durch eine zweite Technik validiert werden
- Datenpräsentation
Transcriptomics Sequencing: RNA-seq
= cDNA Sequencing
cis-kodierte small non-coding RNAs
=antisense RNAs
- 100-7000nts lang
- nicht auf demselben Strang wie das Gen, das sie regulieren
- komplementär zum target transcript (mRNA)
mögliche Regulation:
-Transkription, Translation, mRNA Stabilität
trans kodierte small non-coding RNAs
- 50 -30 nts lang
- normalerweise nicht in der Nähe des Target gens kodiert
- nicht perfekt komplementär
- können ein großes Regulon kontrollieren
mögliche Regulation:
-Transkription, Translation, mRNA Stabilität
