Transkriptionsanalyse Flashcards
(22 cards)
In vivo Methoden zur Transkriptionsanalyse
- Primer extension mapping
- S1 Nuclease protection
- 5`RACE PCR
- Northern hybridization
- qRT PCR
- Promoterfusionen
In vitro Methoden zur Transkriptionsanalyse
- in vitro Transcription
- ROMA (Run off transcription and microarray analysis)
DNA Protein Interaktionen in vitro
- EMSA (gel mobility shift assay)
- DNase I Footprinting
Primer extension mapping (RTase)
- Reverse transkriptase wird eine cDNA, die zum 5’ Ende der mRNA komplementär ist erstellt
- Das Ende des TSS liegt am 5’Ende der mRNA
- 32-P gelabelter Primer wird synthetisiert (ca 75-100nt vom 5’Ende)
- mit Reverse Transkriptase wird eine cDNA, die zum 5’ Ende der mRNA komplementär ist erstellt
- -> Der Transkriptionsstartpunkt kann anhand von Gelelektrophorese sequenziert werden
(easier and faster to perform - but: less sensitive good primer required background bands caused by premature termination of RT due to secondary structures)
S1 nuclease protection analysis
- Target RNA wird mit (5’gelabelten) AS (DNA) Sonden hybridiseirt -> Teilweise überlappende DNA-mRNA Hybride, die den TSS umfassen
- Hybridisierte Fragmente werden vor Nuklease geschützt
- S1 Nuklease entfernt die ssDNA an nicht hybridisierten Stellen–> TSS bleibt
Northern blotting
- denaturiertes RNA sample wird per Gelelektrophorese der Länge nach aufgetrennt aud auf eine Membran aufgebracht
- Mit gelabelten DNA oder RNA Sonden (zB DIG) werden spezifische Transkripte identifiziert und Quantifiziert
label wie DIG können mit antibodies nachgewiesen werden
5’ RACE
5′ RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
- > 5’-End mapping
- eine Sequenz (SP1) muss bekannt sein
1) cDNA wird ausgehend vom SP1 Primer synthetisiert
2) cDNA Produkte erhalten durch PCR Amplifizierung eine 3’ binding Site
- ->Classic oder RLM
3) Sequenzierung um 5’mRNA Ende zu identifizieren
Classic 5`RACE
- Reverse Transkription der mRNA zu cDNA mit dem Genspezifischen Primer SP1
- Terminale Transferase hängt einen poly-A-Tail an das 3’Ende der cDNA
- Ein Anchor Primer wird an den poly-A-tail gehängt
- 1.PCR mit Ankerprimer für Template (mit polyT trakt) und SP2 und mit ankerspez. Primer A1 und SP2
- 2.PCR mit ankerspez. Primer A2 und SP3
- Premature termination of RT results in incomplete cDNAs
- all cDNAs polyadenylated and amplified by PCR
RLM-RACE
- 5’-PPi von der mRNA wird entfernt und ein RNA Anker wird angebracht
- -> Reverse transkription vom GSP aus
- -> cDNA mit Adapter und GSP1-RT
1. PCR: mit Adaptor Primer 1 und GSP1
2. PCR with adaptor primer 2 and GSP2 - Premature terminated cDNAs of RT not RNA adapter ligated
3’ RACE
- Reverse Transcription mit oligo dT Primer (Ankerprimer)
- 1.PCR mit GSP1 und ankerspez. Primer Qo
- 2.PCR mit GSP2 und ankerspez. Primer Qi
Quantitative Realtime PCR (qRT PCR)
- bei mRNA Quantifizierung: Kopplung mit Reverse Transcriptase Reaktion zum Umschreiben von mRNA in cDNA
- -> Quantifizierung der PCR Produkte in Abhängigkeit der Transkriptmenge
- In exponentieller Phase der PCR optimale Reaktionsbedingungen
- delta RN: das von der PCR Reaktion generierte Signal (Fluoreszenz)
- Threshold: Durchschnittliche Standartabweichung von Rn in den ersten PCR Zyklen (vor der exponentiellen Phase)
- Absolute Quantifikation: Vergleich mit einer Standardkurve mit bekannter Nukleinsäuremenge
- Relative Quantifikation: Normalisiert zu Housekeeping Gen -> Referenzgen mit stabiler Expression zum Vergleich
Interkalierende Farbstoffe
Ethidiumbromid:
interkaliert zwischen den Basen von DNA und RNA
-> Fluoresziert unter UV-Licht violett
SYBR Green:
bindet und Fluoresziert nur bei dsDNA
TaqMan Sonden (Hydrolyse Sonden)
- Fluoreszenz des Reporter Fluorophors durch einen Quencher unterdrückt
- Sonde hybridisiert mit komplementären DNA Strang
- Taq Polymerase setzt mit 5‘ 3‘ Exonucleaseaktivität
Reporter frei - Die Fluoreszenz des Reporters nicht mehr durch den Quencher gelöscht
Molecular Beacons
- Oligonucleotide, mit einem Reporter Fluorophor und Quencher gekoppelt
- Nucleotide am 5 Ende zum 3 Ende komplementär –> stem loop
- Reporter durch geringen Abstand zum Quencher keine Fluoreszenz
- Anlagerung der Schleifen Region an komplementäre DNA Sequenz
- Abstand zwischen Quencher und Reporter vergrößert und Reporter Fluoreszenz
FRET
FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer F1 = Fluorochrom 1 A1 = Anregungswellenlänge E1 = Emissionswellenlänge F2 = Fluorochrom 2 A2 = Anregungswellenlänge E2 = Emissionswellenlänge
A1->F1-> (E1->A2) ->F2->E2
Donor Fluorochrom (F 1) durch eine Lichtquelle angeregt, gibt einen Teil seiner Energie an ein in ausreichender Nähe befindliches Akzeptor Fluorochrom ab (F2) -- >Nimmt Abstand zwischen F 1 und F 2 zu, so nimmt FRET und Fluoreszenzsignal des Akzeptors (F 2) ab
Sonden (Hybridisierungs Sonden)
- Donor und Reporter Oligos mit 2 verschiedenen Fluorophoren markiert
- Sonden hybridisieren an die Ziel Sequenz,
Fluorochrome in ausreichende Nähe für FRET gebracht - Reporterfluoreszenz steigt proportional der komplementären DNA
Promoterfusionen mit Reportersystemen
–> lacZ-Gen, phoA-Gen, cat-Gen, gfp-Gen
- Transkriptionelle Gen Fusion: Gene of interest (GOI) und Reporter haben je eine eigene RBS aber Reporter besitzt keinen Promoter
- -> Quantifikation von mRNA
- Translationale Gen Fusion: GOI und Reporter teilen siche eine RBS
- -> Quantifizierung von ProteinLevel
LacZ-Reporter
Gen für beta-Galaktosidase
- -> setzt xGal um -> blauer Farbstoff
- -> ONPG –> gelber Farbstoff
LacI
Kodiert für einen Repressor des lac-Operons
ROMA
ROMA (Run off transcription and microarray analysis
- -> Dient zur Analyse von durch transkriptionsfaktoren regulierte Transkription (zB sigma Faktoren)
- RNA Polymerase, dNTPs und der regulationsfaktor werden zu der DNA mit Promoter gegeben –> Transkription
–> Gelelektrophorese
- RNA –> cDNA -> microarray –> regulons?
EMSA
Electrophoretic mobility shift assay
–> Affinitätselektrophorese zum Nachweis von DNA- oder RNA-bindenden Proteinen, zB Transkriptionsfaktoren
- DNA Fragment am 5’ Ende gelabelt
–> Auf polyacrylamid Gel wandern freie DNA-Fragmente schenller als gebundene mit einem oder mehreren Proteinen
DNase-I Footprinting
Protein-DNA Ingteraktion
- DNA wird gelabelt und von DNase I fragmentiert
- -> Stellen, die Proteingebunden sind werden nicht fragmentiert
- Gelelekrophorese trennt Fragmente auf
- -> An gebundenen Stellen keine Banden
