Übungsfragen Flashcards
(27 cards)
Beschreiben Sie die wichtigsten Schritte der klassischen Sanger-Sequenzierungsmethode
und der Next-Generation Sequenzierungen (Pyrosequenzierung-454 und Solexa). Weisen Sie
auf wesentliche Unterschiede und Verbesserungen der Next-Generation-SequencingTechnologien im Vergleich zur Sanger-Methode hin! (8 Punkte)
Sanger: dideoxy-method
- -> vier parallele Ansätze mit jeweils einer Sorte ddNTP(ohne 3’ hydroxylgruppe führen zu Abbruch der Synthese)
1) Annealing: Primer (32P gelabled) hybridisiert an schon bekannter Sequenz
2) Extension
3) Anhand der Gelelektrophorese sieht man, bei welcher Kettenlänge die jeweilige Sorte an Nukleotiden zum Kettenabbruch geführt hat
Pyrosequencing:
Kettenverlängerung ausgehend von einem Primer
Wenn das korrekte NTP eingebaut wird, wird Pyrophosphat (PPi) freigesetzt. Dieses wird von ATP-Sulfurylase zu ATP umgesetzt. Das führt zu einer Luziferase-Reaktion, wobei Luziferin in Oxyluziferin umgesetzt wird. Dabei entsteht ein detektierbares Lichtsignal (max 4 mal dieselbe base)
454: One fragment = One Bead = One Read
DNA wird fragmentiert und mit Adaptern (A + B) versehen. Die Fragmente werden auf Beads immobilisiert und als single strand (sst) library isoliert
Durch emPCR werden die DNA Fragmente amplifiziert.
Die DNA Beads werden in eine Pico titer platte gegeben
Verbesserung zu Sanger: mehr BP pro run und kein cloning bias
Früher wurden DNA-Sequenzierungen manuell durchgeführt. Welche entscheidenden technischen Verbesserungen haben zur Durchführung der High-Throughput Genomsequenzierung geführt? (6 Punkte)
Technical evolution:
Sequenase:
- genetisch veränderte T7 DNA polymerase
-highly processive (baut 1000e Basen ein bevor sie abdiffundiert)
- baut Nukleotidanaloge ein (zB ddNTPs)
- durch modifizierung fast keine 3’-5’ Exonukleaseaktivität
Fluoreszenzlabels für Primer, capillary-based machines (Cappilar Elektrophorese)
–> Viele Sequenzen können auf einmal gelesen werden ()
Worin bestehen die Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen Pyrosequenzierung (454) und Solexa ? Welche Methode ist am besten geeignet, um ein unbekanntes Genom neu zu sequenzieren und Punktmutationen von bereits sequenzierten Genomen zu korrigieren? (4 Punkte)
454: 25 Mbp/run, 100 bp lange reads, max 5 homopolymerische runs, geeignet für de novo
Solexa: 3000 Mbp/ run, 30 bp lange reads, akkurat für homopolymerische runs, kein de novo
Für beide keine paired reads
Beschreiben Sie kurz eine neue Third-Generation DNA Sequenzierungsmethode und erklären Sie den Unterschied zu Pyrosequenzierung oder Solexa ? (4 Punkte)
- tSMS sequencing
- Exonuclease Sequenzierung
- Sequencing by Synthesis
- Helicos
SMRT sequencing
Nanopore sequencing
Unterschied: Single molecule mehr bp (ausser Helicos) Günstiger Schneller
Beschreiben Sie kurz die einzelnen Schritte eines modernen DNA-Sequenzierungsprojektes bis hin zur Genomannotation. Verwenden Sie dabei auch die Begriffe „contigs“ und „gaps“. (6 Punkte)
- ) DNA wird isoliert
- ) Library wird erstellt
- DNA Fragmente werden in Vektoren eingebracht (geklont) (Plasmide, Lambda Phagen oder künstliche Chromosomen wie YAC, BAC oder PAC)
- entweder Clone by clone oder WGS Sequenzierung der Enden
- Assembly der reads -> Überlappungen führen zu Contigs
- Gap closure
- 2 types of gaps: sequence gaps (ein Klon mit der relevanten Sequenz existiert und die Enden befinden sich in unterschiedlichen Contigs -> mit Primern werden die Stücke nachsequenziert und Gaps geschlossen) physical gap (Sequenzen existieren nicht in der Library, größere Fragmente werden kloniert um sie zu schließen?)
Definieren Sie in einem Satz die folgenden Begriffe: Genom, Transkriptom, Proteom, Metabolom ! (4 Punkte)
Genom: die Gesamtheit der genetischen Information einer Zelle, (also alles im Zellkern, in den Mitochondrien (Chondrom) und den Plastiden (Plastom) enthaltene Erbgut)
Transkriptom: die Gesamtheit aller zu einem bestimmten Zeitpunkt transkribierten Gene in einer Zelle oder in einem Zelltyp
Proteom: die Gesamtheit der (exprimierten) Proteine, die durch das Genom einer Zelle oder eines Organismus codiert werden
Metabolom: alle charakteristischen Stoffwechsel-Eigenschaften einer Zelle bzw. eines Gewebes
Definieren Sie Metagenomics aus akademischer und industrieller Sicht und erklären Sie den experimentellen Ablauf eines Metagenom-Experimentes! (4 Punkte)
Akademisch:
“Culture-independent genomic analysis of
microbial communities and their physiology
= Community genomics
= Environmental genomics”
–> Kultur unabhängige genomische Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften und deren Physiologie
Industriell: "Culture-independent exploitation of untapped microbial biodiversity Enzyme and antibiotic discovery" --> Kultur unabhängige Nutzung unerschlossener microbieller Biodiversität
Ablauf:
- ) Umweltproben sammeln -> Mikrobiota
2) DNA Extraction –> genomische DNA -> Mikrobiom
3) PCR und sequenzierung
- > 16S rRNA Sequenzierung (mikrobielle Diversität)
- -> phylogenetischer Stammbaum
Beschreiben Sie 3 wichtige Schwerpunkte der Metagenomics-Forschung und dabei bisher erzielte Ergebnisse anhand ausgewählter Projekte !
Nennen Sie Ergebnisse der humanen Microbiomforschung, die von Bedeutung sind für die Gesundheitsforschung ! (6 Punkte)
1) Environmental metagenomics (soil, sea water,AMD))
Global ocean sampling
–> 7.7 million sequencing reads (6.3 billion bp) from 41 samples of the marine microbiota - Great diversity and heterogeneity
2) Human microbiome (gut, mouth, skin)
3) Symbiosis (gutless worm, termite gut, whale fall)
- Olavius algarvensis hat 4 Symbiontem
- -> gamma- und delta-Proteobakterien
- Schwefelkreislauf mit Sulfatreduktion und Schwefeloxidation
Humane Mikrobiomforschung:
2 Phyla im Darm (Firmicutes und Bacterioidetes)
–> weniger Bacterioidetes –> Übergewicht
Wozu wird die Sequenzierung der Gene für die 16S RNA angewandt ? (2 Punkte)
Gibt Aufschluss über mikrobielle Diversität
> 300 000 in GenBank
- dient dem Vergleich von Bakteriellen Gemeinschaften
-rRNA ist allgegenwärtig
- stark konserviert
- abundant in allen Zellen
- kein lateraler Transfer
Wie funktioniert die Chip-on-a Chip Methode ? (4 Punkte)
–> chromatin immunoprecipitation followed by microarray detection
- bestehende Protein-DNA Bindungen werden durch Formaldehyd fixiert
- die Zelle wird lysiert und das Chromatin zerstückelt
- ein antikörper bindet spezifisch an das gewünschte Protein –> Immunopräzipitation (isolierung)
- > DNA wird wieder abgetrennt und kann weiter analysiert werden
Beschreiben Sie die Durchführung von Transkriptomanalysen mittels der Microarray-Technologie zur Analyse der transkriptionellen Antwort von Staphylococcus aureus auf oxidativen Stress durch H2O2 !
Transkriptionsanalyse mit Microarray:
RNA von Kontrolle ohne Stress und Experimenteller Gruppe mit Stress wird in gelabelte cDNA transkribiert
-> Cy3-dCTP und Cy5-dCTP Label
- die cDNAs werden auf einem microarray cohybridisiert
–> Spots auf dem Microarray sind DNA Sonden
- Die Fluoreszenzen werden detektiert
Beschreiben Sie die Durchführung von Transkriptomanalysen mittels der Microarray-Technologie an einem selbst gewählten Experiment (z.B. Bacillus subtilis Wildtyp Kontrolle versus Stress) ! (12 Punkte)
12
Wie kann man mittels Pyrosequenzierung Transkriptomanalysen durchführen? (3 Punkte)
–> mRNA in cDNA übertragen
Wann wurde die erste bakterielle Genomsequenz von welchem Bakterium entschlüsselt ? (2 Punkte)
1995: 1. vollständige Genomsequenz eines freilebenden Mikroorganismus:
Haemophilus influenzae
Welche Bedeutung haben die neuen Sequenzierungstechnologien für die Medizin? Beschreiben Sie eine oder mehrere der neuen Sequenzierungs-Technologien, die in der medizinischen Forschung eingesetzt werden ! (6 Punkte)
- über modifizierte Phagen DNA können Bakterien bekämpft werden
- Genomanalyse von Bakterien:
- -> Diversität/ Variationen?
- Translational: Antibiotische Resistenz, outbreak investigation
- Transkriptionell: Virulenz, Resistenz, Adaptation
Beschreiben Sie die Durchführung der Proteomanalyse mittels der 2D-Gelelektrohorese (2D-PAGE) ! Wozu dient die 2D-PAGE ? (6 Punkte)
1) Isoelectric focusing (IEF)
- > Proteine werden anhand des pI Wertes (Isoelektrische Punkt) getrennt (Ladungstrennung)
- ) Auftrennung nach Proteinmasse
- > Streifen mit nach Ladung getrennten Proteinen wird auf SDS Gel gelegt
Unterschiede können detktiert werden indem man 2 Gele übereinander legt
Ziele:
1) Proteinmengen und Proteinsyntheseraten in der Zelle
2) Proteinlokalisation in zellulären Kompartimenten
3) Post-translationalen Modifikationen (PTM)
Beschreiben Sie die Durchführung der 2D-Gel-basierten Proteomanalyse und Möglichkeiten der Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen !
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Nennen Sie 3 Ziele und Anwendungen für Proteomanalysen ! Beschreiben Sie jeweils eine Methode, wie Sie das Proteom einer Laborkultur von Bacillus subtilis und das Proteom von Mikroorganismen im Ozean untersuchen würden ! (12 Punkte)
19)
Proteinidentifikation
Proteinmengen
Proteinlokalisation
PTM
Bacillus subtilis:
- ) Kultivierung von B.subtilis
- ) Präparation der Proteine
- ) 2D PAGE
- ) Picking und Verdau
- ) MALDI-TOF Analys
- ) Protein identifikation
Wir erfolgt die Identifizierung der Proteine mittels Massenspektrometrie ? (6 Punkte)
- -> Bestimmung der Massen von Peptiden
- Ionisation der Peptide und Beschleunigung durch elektrisches Feld
- Auftrennung der Peptide nach Masse/ Ladung-Verhältnis
Theoretische Peptidmassen werden mit experimentellen Peptidmassen verglichen
Elektrospray ionisation oder MALDI-TOF-MS
Sie haben kürzlich aus dem Pazifischen Ozean ein neues nicht-kultivierbares Bakterium isoliert, und möchten das Proteom dieses Bakteriums untersuchen. Ist die gel-basierte Proteomanalyse hier anwendbar oder wie würden Sie vorgehen ? (4 Punkte)
Massenspektrometrie basierte Proteomin
–> Label free
ESI
Gibt es eine Möglichkeit, nicht-kultivierbare Mikroorganismen doch zu kultivieren ? Beschreiben Sie eine neue Technologie dazu ! (4 Punkte)
High throughput cultivation
- Gel micro-droplet (GMD) encapsulation of single cells
- Fluorescence-Activated-Cell-Sorting)
- Screening rates of 5,000 GMDs/second
- Enables HTP isolation and cultivation of previously uncultured microorganisms
- constant media flow
Wie kann man mittels Metagenomics zu neuen Antibiotika oder antimikrobiellen Wirkstoffen kommen? Beschreiben Sie die experimentelle Strategie und auch die Schwierigkeiten im Vergleich zur Suche nach neuen Enzymen ! (6 Punkte)
1) Isolate environmental DNA (e-DNA)
2) Insert e-DNA into convenient bacterial host
3) Screen for antibiotic activity
4) Readily characterized and manipulated
Durch welche globalen transkriptionellen Methoden können Sie bestimmte Regulons charakterisieren ? Beschreiben Sie kurz eine Methode! (6 Punkte)
Cluster analysis?
Hierarchical clustering -> Eisen plots
Durch welche Methoden können Sie die Transkription bestimmter Gene und Operons näher untersuchen und die globalen Ergebnisse bestätigen ? Durch welche Methoden können Sie spezifisch den Transkriptionsstartpunkt, die Transkriptgröße und die Transkriptmenge der Gene des X-Regulons analysieren? Beschreiben Sie kurz mindestens eine transkriptionelle Methode dazu ! (6 Punkte)
TSS:
- Primer extension mapping
- S1 Nuklease Protection array
- RACE
Transkriptgröße:
- Northernblot
Transkriptmenge:
- qRT-PCR
