Proteomics Flashcards
(15 cards)
Methoden für Mikrobielle Proteomics
1) Auftrennen der Proteine in 2D oder 1D Gel
2) Trypsische Spaltung ( nach Arg und Lys)
3) Massenspektrometrie (MS)
4) Datenbankanalysen –> Identifikation von Proteinen
Massenspekrometrie IUPAC
„The study of systems by causing the formation of gaseous ions, with or without fragmentation, which are then characterized by their mass-to-charge ratios and relative abundancies“
Prinzip der Massenspektrometrie
- Bestimmung der Massen von Peptiden
- Ionisation der Peptide und Beschleunigung durch elektrisches Feld
- Auftrennung der Peptide nach Masse/ Ladung-Verhältnis
Elektrospray ionisation oder MALDI-TOF-MS
Aufbau eines Massenspektrometers
- Sample
- Ionenquelle:
- -> Elektrospray ionisation (ESI)
- -> Matrix-assisted Laser desorption Ionization (MALDI)
- Massenanalysator:
- -> Quadrupol
- -> Ion trap (IT)
- -> Time of flight (TOF)
- -> Orbi Trap (OT)
- -> Fourier transform ion
- -> cyclon resonance (FTICR)
- Detektor
ESI -ElectrosprayIonization
- In Methanol oder Acetonitril gelöste Moleküle werden im elektrischen Feld versprüht
- Desolvatation mit warmem Gas
- Meist hoch (2-4-fach) geladene Ionen
- An der Spitze einer Kapillare ist eine Spannung angelegt, wodurch sich ein Überschuss an gleich geladenen Ionen bildet
- Diese Tropfen lösen und verkleinern sich durch verdampfung von Lösemitteln –> Rayleigh Limit
- Durch Abstoßung gleicher Ladungen bleiben irgendwann nur einzelne Ionen übrig (Coloumb Explosion)
MALDI -Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
- Laseranregung einer kristallinen Matrix
- Für sehr große Moleküle (bis 500 kD) geeignet
- Viele einfach geladene Ionen
- Matrix aus Peptiden und einer Matrixlösung bildet einen Kristall
- Ein Laser Impuls führt zu absorption von Energie in der Matrix –> Energie wird für desorption der Peptide genutzt
- Matrix gibt Protonen für die Ionisierung der Peptide ab
- Durch Vergleich von theoretischen und experimentellen Peptidmassen können diese identifiziert werden
Ziele von 2D-Gel-basierter Proteomik
1) Proteinmengen und Proteinsyntheseraten in der Zelle
- unter verschiedenen Wachstumsbedingungen
- in Wildtyp und Mutante
2) Proteinlokalisation in zellulären Kompartimenten
- Zytoplasma, Zellwand, Membran, extrazelluläres Kompartiment
3) Post-translationalen Modifikationen (PTM)
- Phosporylierung, Glykosylierung, Acetylierung,
- Cys-Oxidationen
2D PAGE
- Isoelectric focusing (IEF)
- > Proteine werden anhand des pI Wertes getrennt (Ladungstrennung) - ) Auftrennung nach Proteinmasse
- > Streifen mit nach Ladung getrennten Proteinen wird auf SDS Gel gelegt
Unterschiede können detktiert werden indem man 2 Gele übereinander legt
Phosphoproteomeanalysis
Ser/Thr/Tyr-phosphorylation -> Posttranslationale Modifikation
2 Stainingmethoden
–> Pro-Q-Diamond staining für Phosphoproteom,
Flamingostaining –> Menge
Radiographie mit 33P-gelabelten Proteinen zeigt auch das Phosphoproteom
Non-reducing/ Reducing Diagonal SDS-PAGE analysis
- -> Nachweis von Inter- oder Intramolekularen Disulfiden oder S-Thiolierung
1) Proteine werden mithilfe einer nicht-reduzierenden SDS-PAGE aufgetrennt —> disulfidbrücken bleiben erhalten
2) Der Streifen wird auf ein reduzierendes SDS-PAGE Gel aufgelegt - -> Proteine ohne disulfidbrücken bewegen sich auf einer Diagonalen
- -> Disulfidbrücken zwischen heterodimeren werden gespalten und beide Proteine wandern unter die Diagonale
- -> Homodimere sind als ein Protein unterhalb der Diagonalen zu erkennen
- -> Proteine mit Intramolekularen Disulfidbrücken zeigen sich als einzelne Proteine oberhalb der Diagonalen
Prinzip der Fluoreszenz-Redoxproteomik
- Fluoreszenz-Markierung von oxidierten Proteinen nach Reduktion
- Identifizierung von Proteinen mit Disulfiden nach ROS-Stress im Proteom
–> Reduzierte Thiole werden alkyiert, diesulfidbrücken werden reduziert und neu entstandene Thiole werden mit fluoreszenz alkyliert
MS-basierte Redox proteomics
Differentielle Alkylierung mit maleimide-and iodoacetamide-probes
-> mit 12C-ICAT und 13C-ICAT isotopen tags
1. Alkylierung mit einem Tag
Reduktion
2. Alkylierung mit anderem Tag
- Trypsin verdau
- MS –> unterschiedliche Isotopenmassen (9DA)
Massenspektrometrie-basierte Proteomik
- Metabolisches Labelling (SILAC)
- Chemisches Labelling (ICAT)
- Label-freie Quantifizierung
SILAC
Stable isotope labelling by aminoacids in cellcultures
–> experimental group wächst auf 13C6-Lysin medium, control auf 12C6-Lysin
–> 6Da Mass shift
(auch 15N/14N)
ICAT
Isotope-Coded Affinity Tags
- Massendifferenz 8Da
- Leichte ICAT Label: Linker =Hydrogen
- Schwere ICAT Label Linker = Deuterium
- Cysteine werden mit ICAT gelabelt (eine Gruppe leicht, eine schwer)
- Beide Gruppen werden zusammengatan und Trypsinverdaut
- Gelabelte Fragmente nach Affinität isoliert
- -> MS
