ExGen07- Technologies de l'ADN recombinant

Question 1

1. Définition des biotechnologies liées à l’ADN recombinant

Answer 1

ADN recombinant

• Définition : L’ADN recombinant est une molécule d’ADN artificielle créée en combinant des séquences d’ADN provenant de sources différentes.
• Exemple : Par exemple, on peut prendre un fragment d’ADN contenant un gène d’intérêt d’un organisme donneur (comme un humain, une plante ou une bactérie) et l’insérer dans un vecteur d’ADN, qui est souvent un plasmide bactérien. Ce vecteur peut provenir d’une espèce totalement différente, ce qui permet de transférer et de multiplier ce matériel génétique dans un nouvel hôte.
• Importance : Cette technique est fondamentale car elle permet de manipuler et d’étudier des gènes spécifiques, de produire des protéines d’intérêt, ou de modifier génétiquement des organismes.

Génie génétique (ou ingénierie génétique)

• Définition : C’est un domaine scientifique qui utilise les outils de la biologie moléculaire et les connaissances en génétique pour manipuler le génome des êtres vivants.
• Actions possibles : Modifier, reproduire ou utiliser des gènes en introduisant, supprimant ou modifiant des séquences d’ADN dans un organisme.
• Applications pratiques :
  
  • Santé : Développement de médicaments innovants, comme la thérapie génique qui vise à corriger un gène défectueux responsable d’une maladie.
  • Agriculture : Création de plantes génétiquement modifiées (OGM) avec des caractéristiques améliorées (résistance aux maladies, tolérance à la sécheresse, meilleure valeur nutritionnelle).
  • Recherche fondamentale : Exploration des fonctions des gènes, compréhension des mécanismes biologiques, développement de modèles cellulaires ou animaux.

Cela fait du génie génétique un champ d’application très vaste et multidisciplinaire.

Clonage

• Définition : Le clonage est une technique qui permet de produire des copies génétiquement identiques à partir d’une cellule ou d’un fragment d’ADN.
• Types de clonage :
  
  • Clonage cellulaire : Production de nombreuses cellules identiques à partir d’une cellule initiale. Utile pour amplifier des cellules exprimant un gène d’intérêt.
  • Clonage moléculaire : Amplification d’un fragment d’ADN spécifique. Cela implique l’insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur (par exemple un plasmide), puis la multiplication de ce vecteur dans un micro-organisme (souvent une bactérie).
• But : Obtenir un grand nombre de copies identiques qui peuvent être utilisées pour la production de protéines, l’étude génétique ou d’autres applications.

Résumé

En résumé, ces trois concepts sont liés mais distincts : l’ADN recombinant est le produit obtenu en combinant des séquences génétiques, le génie génétique regroupe les techniques permettant de manipuler cet ADN, et le clonage est une méthode spécifique pour amplifier soit des cellules, soit des fragments d’ADN, souvent dans le but de produire des protéines ou d’étudier des gènes. Ces technologies sont à la base de la biotechnologie moderne, avec des applications majeures en médecine, agriculture et recherche [[209]].

Question 2

Partie 2 : Les étapes de construction d’un ADN recombinant

Answer 2

La construction d’un ADN recombinant (ADNr) est un processus clé en biotechnologie et génie génétique qui permet d’isoler un gène d’intérêt, de l’insérer dans un vecteur, puis de produire des copies de ce gène et/ou la protéine qu’il code dans une cellule hôte. Voici les étapes détaillées :

1. Isolement du gène d’intérêt

• Le point de départ est d’obtenir le fragment d’ADN contenant le gène que l’on souhaite étudier ou exprimer.
• Ce gène peut être isolé à partir de l’ADN génomique de l’organisme donneur ou à partir d’ADNc (ADN complémentaire) qui est une copie d’ARN messager mature, dépourvue des introns, utile pour produire des protéines recombinantes chez des hôtes comme les bactéries qui ne font pas d’épissage.
• L’isolement peut se faire par des techniques telles que la PCR, les enzymes de restriction, ou des bibliothèques d’ADNc.

2. Préparation du vecteur et de l’ADN à cloner

• Le vecteur est une molécule d’ADN, souvent un plasmide bactérien ou un virus modifié, capable de transporter le gène d’intérêt dans la cellule hôte.
• Le vecteur est digéré par des enzymes de restriction (endonucleases) pour ouvrir la molécule d’ADN à un endroit précis, préparant ainsi un site d’insertion compatible avec le fragment d’ADN isolé.
• De même, le fragment d’ADN contenant le gène d’intérêt est traité avec les mêmes enzymes pour avoir des extrémités compatibles, facilitant l’insertion.

3. Insertion de l’ADN dans le vecteur et ligation

• Le fragment d’ADN est inséré dans le vecteur ouvert.
• Une enzyme appelée ligase est utilisée pour lier covalemment les extrémités d’ADN du vecteur et du fragment inséré, formant ainsi une molécule d’ADN recombinant stable.
• Cette étape est cruciale pour créer un plasmide recombinant qui pourra être reconnu et répliqué dans la cellule hôte.

4. Introduction du vecteur recombinant dans la cellule hôte appropriée

• Le vecteur recombinant est introduit dans une cellule hôte, souvent une bactérie comme E. coli, via un procédé appelé transformation (pour les bactéries), ou transfection (pour les cellules eucaryotes).
• Cette étape nécessite parfois des techniques spécifiques pour rendre les cellules compétentes à capter l’ADN, comme un choc thermique, l’électroporation ou l’utilisation de liposomes.
• La cellule hôte va ensuite reconnaître le vecteur et le répliquer.

5. Amplification de la molécule d’ADN recombinant dans la cellule hôte

• Une fois dans la cellule, le vecteur recombinant est répliqué lors de la division cellulaire.
• Cela permet d’obtenir un grand nombre de copies identiques du gène d’intérêt.
• Cette amplification est essentielle pour obtenir suffisamment d’ADN recombinant pour des applications ultérieures.

6. Production de protéines recombinantes (si l’ADNr est un ADNc)

• Si le fragment inséré est un ADN complémentaire (ADNc) qui code pour une protéine, la cellule hôte peut transcrire et traduire ce gène pour produire la protéine recombinante.
• Cette protéine peut alors être extraite, purifiée et utilisée à diverses fins (médicinales, industrielles, recherche).

Applications principales de cette technologie

La technologie de l’ADN recombinant permet la production de nombreuses protéines thérapeutiques importantes, notamment :

• Insuline recombinante pour le traitement du diabète.
• Facteurs de coagulation (Facteur VIII et IX) pour les hémophilies A et B.
• Hormones de croissance (HGH).
• Erythropoïétine (EPO) pour traiter l’anémie.
• Interférons pour lutter contre des infections virales ou certains cancers.
• Anticorps monoclonaux pour le traitement de maladies auto-immunes et cancers.
• Thérapie génique où des gènes thérapeutiques sont introduits dans les cellules des patients.
• Diagnostics médicaux basés sur des protéines recombinantes [[210]].

Remarque importante

• La protéine recombinante est souvent différente de la protéine naturellement synthétisée par l’organisme qui la produit, notamment si la cellule hôte est différente de l’organisme d’origine (ex : insuline humaine produite dans des bactéries).
• La qualité, le repliement correct et les modifications post-traductionnelles peuvent varier selon le système d’expression utilisé, ce qui influence la fonctionnalité de la protéine recombinante [[211-215]].

En résumé, la construction d’un ADN recombinant est un processus méthodique qui commence par l’isolement d’un gène, son insertion dans un vecteur, et se termine par son expression dans une cellule hôte, permettant la production de protéines recombinantes d’intérêt pour de multiples applications. Ce procédé est à la base de nombreuses avancées biotechnologiques et médicales actuelles.

Question 3

3. Systèmes d’expression de protéines recombinantes

Answer 3

Pour produire des protéines recombinantes, on utilise différents types de cellules hôtes selon les besoins spécifiques liés à la nature de la protéine et à son usage final. Les principaux systèmes sont :

• Bactéries (ex : Escherichia coli)
• Levures
• Cellules d’insectes
• Cellules de mammifères

Chacun de ces systèmes a des caractéristiques propres qui influencent la qualité, la quantité, la fonctionnalité et le coût de production des protéines recombinantes.

A. Bactéries (E. coli)

• Avantages :
  
  • Coûts faibles pour la culture et la production.
  • Rendement élevé : peuvent produire jusqu’à 50% des protéines intracellulaires.
  • Large disponibilité de plasmides (vecteurs) et outils génétiques.
• Inconvénients :
  
  • Mauvais repliement des protéines eucaryotes : les protéines complexes peuvent s’agréger en corps d’inclusion insolubles.
  • Absence des modifications post-traductionnelles (PTM) eucaryotes telles que la glycosylation et les ponts disulfures qui sont souvent indispensables à la fonction et la stabilité des protéines.
  • Problèmes de solubilité et activité fonctionnelle réduite.
  • Difficulté à exprimer des protéines de haut poids moléculaire.
  • Risque de contamination par des endotoxines bactériennes, ce qui est problématique en production pharmaceutique [[212]].

B. Levures

• Avantages :
  
  • Toujours des coûts relativement faibles.
  • Bon rendement.
  • Capacité à sécréter les protéines recombinantes dans le milieu de culture, facilitant la purification.
  • Existence de modifications post-traductionnelles (PTM) comme la glycosylation et la phosphorylation.
• Inconvénients :
  
  • Les PTM des levures diffèrent de celles des mammifères, notamment une sur-glycosylation qui peut altérer la structure et la bioactivité des protéines.
  • Risques de réactions antigéniques si les protéines recombinantes sont utilisées chez l’homme.
  • Moins de vecteurs disponibles comparé aux bactéries [[213]].

C. Cellules d’insectes (système baculovirus)

• Ce système utilise des cellules d’insectes infectées par un baculovirus modifié pour exprimer la protéine d’intérêt.
• Avantages :
  
  • Les PTM sont plus proches de celles des mammifères comparées aux levures et bactéries.
  • Meilleure solubilité des protéines recombinantes.
  • Rendement élevé.
• Inconvénients :
  
  • La N-glycosylation est encore différente de celle des mammifères, ce qui peut entraîner des réactions antigéniques.
  • Risque de formation de corps d’inclusion insolubles lors de la surexpression.
  • Bien que les protéines soient plus proches du naturel, elles ne sont pas totalement identiques à celles produites dans des cellules mammifères [[214]].

D. Cellules de mammifères

• Avantages :
  
  • Système idéal pour produire des protéines humaines fonctionnelles.
  • Repliement des protéines optimal grâce à la machinerie cellulaire appropriée (présence de protéines chaperones).
  • Modifications post-traductionnelles correctes et complètes (glycosylation, phosphorylation, ponts disulfures), ce qui confère à la protéine une bioactivité maximale.
  • Possibilité de diriger la protéine vers le compartiment cellulaire approprié (ex : sécrétion).
• Inconvénients :
  
  • Rendement de production plus faible comparé aux autres systèmes.
  • Temps de production plus long.
  • Coûts de culture élevés, besoin de main-d’œuvre qualifiée et d’installations spécialisées.
• Ce système est privilégié pour la production de protéines thérapeutiques où la qualité et la fonctionnalité sont critiques [[215]].

Conclusion

Le choix du système d’expression dépend donc d’un compromis entre :

• Le coût et la rapidité de production (bactéries et levures favorisées).
• La nécessité de modifications post-traductionnelles correctes pour la fonctionnalité de la protéine (cellules d’insectes ou mammifères).
• La nature de la protéine cible (taille, complexité, besoin en PTM).
• L’usage final du produit (recherche, diagnostic, thérapie).

Ce choix est crucial pour obtenir une protéine recombinante fonctionnelle, soluble, active et sûre, adaptée à l’application souhaitée.

Question 4

4. Vecteurs d’expression adaptés au système d’expression

Answer 4

Les vecteurs d’expression sont des molécules d’ADN artificielles conçues pour introduire un gène d’intérêt dans une cellule hôte afin d’y produire la protéine correspondante. Ces vecteurs sont adaptés selon le type de cellule hôte utilisé (bactéries ou cellules humaines) car les mécanismes de transcription et traduction diffèrent selon les organismes.

4.1 Vecteurs d’expression dans les bactéries (notamment Escherichia coli)

Composition d’un vecteur bactérien d’expression :

• Promoteur bactérien (P) : région d’ADN où l’ARN polymérase bactérienne se fixe pour initier la transcription du gène d’intérêt. Exemples de promoteurs :
  
  • pLac (et ses mutants) : inducible par IPTG (analogue non métabolisable du lactose).
  • pTrp
  • pTac : hybride entre pLac et pTrp, à activité plus élevée que pLac.
  • pT7 : reconnu par l’ARN polymérase T7 très spécifique, utilisée dans des souches bactériennes modifiées.
  • pBAD : inducible par arabinose.
  • pR et pL du phage λ : promoteurs forts, régulés par des répresseurs spécifiques.
• Site multiple de clonage (MCS) : région contenant plusieurs sites de restriction permettant l’insertion du fragment d’ADN à cloner (gène d’intérêt).
• Origine de réplication (ori) : séquence permettant au plasmide de se répliquer indépendamment dans la bactérie.
• Marqueur de sélection : généralement un gène conférant une résistance à un antibiotique (ex : ampicilline), permettant de sélectionner uniquement les bactéries ayant incorporé le plasmide.
• Ribosome Binding Site (RBS) ou séquence Shine-Dalgarno (SD) : séquence en amont du codon start qui permet la reconnaissance et la fixation du ribosome pour initier la traduction.
• Séquences de terminaison de transcription : permettent l’arrêt correct de la transcription.
• Gène codant le répresseur : dans certains cas, un gène codant pour un répresseur qui se fixe sur le site opérateur et régule l’activité du promoteur (ex : répresseur LacI qui contrôle pLac).

Fonctionnement des promoteurs bactérien :

• Les promoteurs comme pLac sont souvent inductibles, c’est-à-dire que la transcription est faible en absence d’inducteur et fortement activée en présence d’une molécule spécifique (ex : IPTG pour pLac).
• Le système peut présenter un risque de “fuite d’expression” (expression faible même sans inducteur) si le nombre de répresseurs est insuffisant par rapport au nombre de sites opérateurs.
• Des mutants de promoteurs (ex : pLacUV5, pTac) ont été développés pour augmenter l’activité transcriptionnelle.

Souches bactériennes modifiées pour expression contrôlée :

• Par exemple, la souche E. coli BL21(DE3) contient un prophage DE3 codant pour l’ARN polymérase T7 sous le contrôle du promoteur pLac. Cela permet d’utiliser un vecteur contenant un promoteur pT7 sur le plasmide. En présence d’IPTG, la polymérase T7 est exprimée et transcrit fortement le gène sous pT7, assurant une expression élevée et spécifique.

Induction par différents inducteurs :

• IPTG pour pLac et dérivés.
• Arabinose pour pBAD, avec expression dose-dépendante.
• Réponse à la SOS bactérienne pour pL du phage λ, où la protéine répresseur λcI est clivée, permettant transcription.

4.2 Vecteurs d’expression dans les cellules humaines (mammifères)

Les vecteurs pour cellules eucaryotes nécessitent des promoteurs spécifiques adaptés à la machinerie transcriptionnelle des cellules humaines.

Promoteurs constitutifs (exprimant en permanence) :

• P CMV (cytomégalovirus) : promoteur viral fort très utilisé, actif dans de nombreux types cellulaires.
• P EF-1α (facteur d’élongation eucaryote 1 alpha) : promoteur robuste également très utilisé.
• P CAG : promoteur hybride combinant une région enhancers du CMV, le promoteur de l’actine beta du poulet et un site d’épissage de l’actine beta du lapin, assurant une expression forte et stable.

Ces promoteurs assurent une expression continue du gène d’intérêt sans nécessité d’inductions externes.

Promoteurs inductibles :

• Système Tet (tétracycline) :
  
  • Tet-On : en présence de tétracycline (ou doxycycline), le facteur de transcription rtTA se lie au promoteur, activant la transcription.
  • Tet-Off : en présence de tétracycline, le facteur tTA ne peut pas se lier au promoteur, inhibant la transcription.
  Ce système permet un contrôle précis de l’expression génique par ajout ou retrait de tétracycline.
• Système Cumate :
  
  • Basé sur un répresseur (CymR) et un opérateur (CuO) dérivés de la bactérie Pseudomonas putida.
  • En présence de cumate, le répresseur est libéré de l’opérateur, permettant la transcription.
  • Fonctionnement similaire au système Tet, donnant un autre moyen d’induction contrôlée.

Autres éléments importants des vecteurs eucaryotes :

• Séquences d’amorçage et d’épissage, permettant un traitement approprié du transcrit.
• Séquences polyA pour stabiliser l’ARNm.
• Marqueurs de sélection pour eucaryotes (ex : résistance à la néomycine/G418).

Synthèse

Les vecteurs d’expression sont des outils complexes adaptés au système cellulaire utilisé :

• En bactéries, ils combinent promoteurs inductibles forts, séquences pour initiation de la traduction (Shine-Dalgarno), origines de réplication plasmidique et marqueurs antibiotiques pour une expression rapide, forte et contrôlée.
• En cellules humaines, ils utilisent des promoteurs viraux ou cellulaires forts, constitutifs ou inductibles, pour permettre une expression stable ou régulée, avec un contrôle fin via des systèmes d’induction comme Tet-On/Tet-Off ou Cumate.

Le choix de promoteur et vecteur dépendra donc du type de cellule hôte, du besoin d’expression contrôlée, de la nature de la protéine à produire, et du contexte expérimental ou thérapeutique [[216-227]].

Question 5

5. Transfection transitoire versus transfection stable

Answer 5

La transfection est la méthode utilisée pour introduire un gène d’intérêt (un ADN étranger) dans des cellules eucaryotes afin que ces cellules expriment la protéine codée par ce gène.

Il existe deux grands types de transfection, qui diffèrent par la durée et la stabilité de l’expression du gène introduit :

A. Transfection transitoire

• Définition : Le gène d’intérêt est introduit dans la cellule mais n’est pas intégré dans le génome de la cellule hôte.
• Conséquences sur l’expression : L’expression du gène est temporaire. Elle persiste seulement pendant un temps limité, généralement quelques jours.
• Mécanismes de perte : La perte du gène introduit est due à plusieurs facteurs :
  
  • La division cellulaire : lors de la mitose, le plasmide (ou ADN exogène) est réparti de manière non équitable ou diluée car il ne fait pas partie du génome.
  • La dégradation de l’ADN exogène par des mécanismes cellulaires.
  • La méthylation du promoteur du gène introduit, qui peut conduire à une inactivation transcriptionnelle.
• Utilisation typique : Cette méthode est souvent utilisée pour des expériences à court terme, par exemple pour étudier rapidement la fonction d’un gène ou la production immédiate d’une protéine recombinante.

B. Transfection stable

• Définition : Le gène d’intérêt est intégré dans le génome de la cellule hôte.
• Conséquences sur l’expression : L’expression du gène est durable et stable dans le temps, pouvant persister aussi longtemps que la cellule vit et se divise.
• Sélection des cellules :
  
  • Après la transfection, les cellules sont cultivées en présence d’un antibiotique (par exemple, néomycine ou G418).
  • Seules les cellules ayant intégré le gène d’intérêt avec un marqueur de résistance antibiotique survivent (car le vecteur contient un gène de résistance).
• Résultat : On obtient une population de cellules exprimant le gène d’intérêt de façon stable.
• Limite possible : L’expression peut être inhibée si le promoteur contrôlant le gène est méthylé, ce qui est un mécanisme épigénétique d’inactivation.
• Utilisation typique : La transfection stable est utilisée pour produire des lignées cellulaires exprimant de façon permanente une protéine recombinante, utile pour des études à long terme, la production industrielle, ou des applications thérapeutiques.

C. Processus après la transfection (illustré dans le document)

1. Collecte des cellules transfectées : Après introduction de l’ADN, les cellules sont laissées 24-48 heures pour exprimer le gène.
2. Traitement à l’antibiotique : Pour la transfection stable, un antibiotique est ajouté pour sélectionner les cellules qui ont intégré le gène.
3. Résultats de la sélection :
   
   • Certaines cellules ne portent pas le gène et meurent.
   • D’autres expriment le gène avec des niveaux variables (population polyclonale).
4. Isolation de clones monoclonaux : Pour obtenir une population homogène, on effectue une dilution limite afin d’isoler des clones cellulaires uniques exprimant le gène à un niveau stable et uniforme.

En résumé

• La transfection transitoire est rapide mais temporaire, sans intégration dans le génome.
• La transfection stable nécessite une étape de sélection et donne une expression permanente du gène.
• Le choix entre les deux dépend de l’objectif expérimental (court terme vs long terme) et de la nécessité d’une expression stable.