ExG 2- Réplication chez les eucaryotes

Question 1

Mécanisme général partagé avec les bactéries

Answer 1

La réplication de l’ADN chez les eucaryotes suit des principes fondamentaux similaires à ceux observés chez les bactéries :

• Mécanisme semi-conservatif : Chaque molécule d’ADN fille formée conserve un des deux brins originaux (parentaux), tandis que l’autre brin est nouvellement synthétisé. Cela signifie qu’après réplication, chaque ADN double brin est constitué d’un brin ancien et d’un brin nouvellement synthétisé. Ce mécanisme a été démontré par l’expérience classique de Meselson et Stahl [[38]].
• Réplication bidirectionnelle : La réplication démarre à des points spécifiques appelés origines de réplication et progresse dans deux directions opposées à partir de chaque origine. Cela forme des fourches de réplication qui avancent le long de l’ADN double brin.
• Substrats utilisés : La synthèse d’ADN utilise des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP) comme substrats activés. Ces dNTP fournissent l’énergie nécessaire à la formation des nouvelles liaisons phosphodiesters entre les nucléotides.
• Matrice et amorce : La synthèse d’un nouveau brin d’ADN nécessite une matrice d’ADN monocaténaire (simple brin) pour que l’ADN polymérase puisse ajouter des nucléotides complémentaires. De plus, elle nécessite une amorce avec une extrémité 3’-OH libre, souvent constituée d’une courte séquence d’ARN synthétisée par une primase, pour initier la synthèse.
• Synthèse asymétrique : Les deux brins de la double hélice sont répliqués de façon différente au niveau de la fourche de réplication :
  • Le brin avancé est synthétisé de manière continue dans le sens 5’→3’ en suivant la progression de la fourche.
  • Le brin retardé est synthétisé de manière discontinue sous forme de fragments d’Okazaki, qui sont ensuite reliés.

Question 2

Spécificités liées aux eucaryotes

Answer 2

Les eucaryotes possèdent des particularités qui rendent la réplication plus complexe et finement régulée :

• Taille des génomes : Les génomes eucaryotes sont beaucoup plus grands que ceux des bactéries, avec des millions à des milliards de paires de bases. Pour répliquer efficacement ces grands génomes, la cellule utilise plusieurs milliers d’origines de réplication (environ 20 000 à 30 000 chez l’Homme), chacune contrôlant un segment appelé réplicon (d’environ 100 à 200 kilobases). Cela permet une réplication coordonnée et rapide malgré la taille importante du génome [[39]].
• Structure chromatinienne : L’ADN eucaryote est enroulé autour de protéines histones pour former la chromatine, ce qui rend l’ADN moins accessible. La réplication doit ainsi s’accompagner d’un remodelage chromatinien, notamment le déplacement et la réassemblage des nucléosomes (unités de base de la chromatine formées d’ADN enroulé autour d’un octamère d’histones). Ce conditionnement impacte la vitesse et la régulation de la réplication.
• ADN linéaire et télomères : Contrairement aux bactéries qui ont généralement un ADN circulaire, les chromosomes eucaryotes sont linéaires, ce qui pose un problème lors de la réplication des extrémités des chromosomes (les télomères). Sans mécanismes spécifiques, les extrémités perdraient régulièrement des séquences au fil des divisions cellulaires. Pour cela, les eucaryotes utilisent la télomérase, une enzyme spécialisée qui rallonge les télomères en ajoutant des répétitions spécifiques (TTAGGG chez les humains), protégeant ainsi la stabilité chromosome et la capacité de réplication complète des chromosomes [[37]], [[39]], [[63]].
• Vitesse de réplication : La vitesse de réplication chez les eucaryotes est plus lente (~200 bases par seconde) que chez les bactéries (~1000 bases par seconde), en partie à cause de la nécessité de gérer la chromatine et la complexité des mécanismes régulateurs [[39]].

En résumé, la réplication de l’ADN chez les eucaryotes conserve les principes fondamentaux de la réplication observés chez les bactéries, mais elle est adaptée pour gérer la complexité liée à la taille du génome, la structure chromatinienne et la linéarité des chromosomes. Ces adaptations impliquent un contrôle rigoureux et des mécanismes spécialisés pour assurer une réplication fidèle et complète de l’information génétique [[37]], [[39]].

Question 3

a) Les ADN polymérases eucaryotes

Answer 3

Les eucaryotes possèdent au moins 15 ADN polymérases différentes, qui ont des rôles spécifiques dans la réplication et la réparation de l’ADN. Toutes catalysent la synthèse d’ADN dans le sens 5’->3’ en utilisant un ADN matrice simple brin.

• Pol α (alpha) :
  Cette polymérase est unique car elle a une double fonction. Elle agit initialement comme une primase, c’est-à-dire qu’elle synthétise une amorce courte d’ARN (nécessaire pour démarrer la synthèse de l’ADN). Ensuite, elle allonge cette amorce avec quelques nucléotides d’ADN. Pol α est donc essentielle pour initier la synthèse des deux brins (avancé et retardé) [[42]].
• Pol β (bêta) :
  Principalement impliquée dans la réparation de l’ADN, notamment dans la réparation des cassures simples et la traduction de césure (réparation des fragments d’Okazaki). Elle ne participe pas directement à la réplication principale mais joue un rôle dans le maintien de l’intégrité du génome [[42]].
• Pol γ (gamma) :
  C’est la polymérase responsable de la réplication de l’ADN mitochondrial, un ADN distinct du génome nucléaire. Elle possède aussi une activité d’auto-correction (exonucléase 3’->5’) qui augmente la fidélité de la réplication mitochondriale [[42]], [[44]].
• Pol δ (delta) :
  La principale polymérase du brin retardé, c’est-à-dire qu’elle synthétise les fragments d’Okazaki de manière très processive (capable de synthétiser de longs fragments sans se détacher). Elle possède également une activité d’exonucléase 3’->5’ pour corriger les erreurs de synthèse, ce qui augmente la fidélité de la réplication [[42]], [[44]].
• Pol ε (epsilon) :
  La polymérase principale du brin avancé, synthétisant de façon continue et hautement processive. Elle aussi possède une activité d’auto-correction par exonucléase 3’->5’, ce qui est crucial pour la fidélité de la réplication [[42]], [[44]].
• Pol η, ι, κ, Rev1 et ζ :
  Ces polymérases sont spécialisées dans la réplication des zones endommagées de l’ADN (réplication translesion), permettant à la fourche de réplication de progresser malgré la présence de lésions. Elles sont moins fidèles et favorisent la tolérance aux dommages [[42]].
• Autres polymérases moins caractérisées :
  θ, λ, φ, σ, μ dont les rôles précis restent à élucider, mais elles interviennent dans diverses voies de réparation et réplication spécialisée [[42]].

Remarque importante :
Aucune des polymérases eucaryotes n’a une activité 5’->3’ exonucléase, ce qui signifie qu’elles ne peuvent pas retirer les amorces d’ARN. Cette fonction est assurée par d’autres enzymes comme FEN1 et RNAse H, qui éliminent spécifiquement ces amorces pour permettre la synthèse continue et la ligature des fragments d’Okazaki [[42]].

Question 4

b) Complexe MCM (Mini Chromosome Maintenance)

Answer 4

Le complexe MCM est une hélicase essentielle qui sépare les deux brins de la double hélice d’ADN avant leur réplication. C’est un acteur clé du démarrage et de la progression de la fourche de réplication.

• Il est constitué de six sous-unités (MCM2 à MCM7) qui forment un anneau permettant d’encercler l’ADN double brin avant sa séparation.
• Le complexe comprend aussi les protéines cdc45 et GINS qui aident à activer l’hélicase, à maintenir sa structure fermée et à coordonner son fonctionnement avec l’ADN polymérase α (primase), facilitant ainsi le démarrage de la synthèse [[45]], [[46]].
• L’hélicase MCM consomme de l’ATP pour « dérouler » l’ADN à un rythme d’environ 300 nucléotides par seconde, créant ainsi la matrice simple brin nécessaire à la synthèse d’ADN [[46]].

Question 5

c) Complexe RPA (Replication Protein A)

Answer 5

RPA est un complexe protéique qui joue plusieurs rôles cruciaux :

• Il se fixe sur l’ADN simple brin exposé lors de la séparation des brins (par l’hélicase MCM).
• Stabilise ces portions d’ADN simple brin pour éviter la formation de structures secondaires indésirables comme les épingles à cheveux.
• Protège l’ADN simple brin de la dégradation enzymatique.
• Participe aussi à l’activation de systèmes de réparation de l’ADN si nécessaire [[47]].

Le complexe RPA est constitué de trois sous-unités : RPA70 (avec 3 domaines de fixation à l’ADN), RPA32 (1 domaine) et RPA14 (régulatrice) [[47]].

Question 6

d) RFC (Replication Factor C) et PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)

Answer 6

• RFC est un chargeur de pince. Sa fonction principale est d’ouvrir le complexe PCNA et de le placer autour de l’ADN simple brin au niveau de la fourche de réplication.
• PCNA forme une pince qui s’enroule autour de l’ADN et sert de plateforme pour les ADN polymérases δ et ε, augmentant considérablement leur processivité, c’est-à-dire leur capacité à synthétiser de longues séquences d’ADN sans se détacher [[48]].

Question 7

e) Topoisomérases

Answer 7

Lors de la réplication, l’ADN en amont de la fourche de réplication s’enroule et s’entortille, créant des contraintes topologiques.

• Topo-isomérase I :
  Enzyme monomérique, ATP-indépendante, qui coupe un seul brin d’ADN permettant à l’autre brin de passer dessus, soulageant ainsi les tensions de torsion [[49]].
• Topo-isomérase II :
  Homodimère ATP-dépendant, qui coupe les deux brins d’ADN de manière transitoire pour désentrelacer les molécules d’ADN (décaténation) et soulager les contraintes de torsion plus importantes [[49]].

Le mécanisme de coupure implique une liaison covalente entre un résidu tyrosine de la topoisomérase et l’ADN, ce qui permet une coupure transestérification réversible [[49]].

Question 8

f) Autres protéines impliquées dans la réplication

Answer 8

• RNAse FEN1 et RNAse H :
  Enzymes responsables de l’élimination des amorces d’ARN placées par la primase pour initier la synthèse des fragments d’Okazaki. Elles clivent spécifiquement ces amorces pour permettre la synthèse continue [[45]].
• ADN ligase Lig1 :
  Après l’élimination des amorces, elle reforme les liaisons phosphodiesters entre les fragments d’Okazaki, assurant ainsi la continuité du brin retardé [[45]].

En résumé :
La réplication de l’ADN chez les eucaryotes est un processus complexe et finement orchestré impliquant une large variété de protéines spécialisées. Les ADN polymérases principales (Pol δ et Pol ε) sont accompagnées de complexes protéiques (MCM, RPA, PCNA, RFC) qui assurent le déroulement de la double hélice, la protection des brins simples, la processivité de la synthèse, et la gestion des contraintes topologiques (topoisomérases). L’élimination des amorces d’ARN et la réparation des césures sont assurées par des enzymes spécifiques. Ce système complexe garantit la fidélité et l’efficacité de la réplication du génome eucaryote [[42]–[49]].

Question 9

Réplication des deux brins d’ADN par des mécanismes distincts

Answer 9

• La réplication se fait au niveau de la fourche de réplication où la double hélice est déroulée.
• Les deux brins d’ADN sont copiés selon des mécanismes différents :
  
  • Brin avancé (leading strand) : synthèse continue dans le sens de l’ouverture de la fourche.
  • Brin retardé (lagging strand) : synthèse discontinue, par fragments appelés fragments d’Okazaki, qui sont ensuite assemblés.

Question 10

Élimination des amorces d’ARN et réparation des césures

Answer 10

• La synthèse d’ADN nécessite une amorce d’ARN pour fournir un 3’-OH libre.
• Ces amorces d’ARN sont ensuite éliminées pour que le brin d’ADN soit continu :
  
  • Deux enzymes endonucléases interviennent : FEN1 (Flap Endonuclease 1) et RNAse H.
  • FEN1 coupe les fragments d’ARN qui dépassent sous forme de “flap” (éperon).
  • RNAse H dégrade l’amorce ARN hybridée à l’ADN.
• Après élimination des amorces, il reste des césures (ruptures dans la chaîne d’ADN) entre les fragments d’Okazaki.
• Ces césures sont réparées par l’ADN polymérase β (Pol β), qui comble les espaces par l’ajout de nucléotides.
• Enfin, l’ADN ligase (Lig1) reforme les liaisons phosphodiesters entre les fragments, assurant un brin continu.

Question 11

Mécanisme de translation de césure (détaillé)

Answer 11

• L’ADN ligase fonctionne via un mécanisme en plusieurs étapes :
  
  1. Activation de l’enzyme par adénylation (fixation d’un groupement AMP sur un résidu lysine).
  2. Transfert de l’AMP sur l’extrémité 5’ phosphate libre de l’ADN.
  3. Attaque nucléophile par le groupement 3’-OH adjacent qui forme une liaison covalente phosphodiester, libérant l’AMP et scellant la césure.

Question 12

Initiation de la réplication : formation du pré-complexe de réplication (pre-RC)

Answer 12

• La réplication démarre par la formation d’un complexe préliminaire appelé pré-complexe de réplication (pre-RC).
• Ce pre-RC est assemblé sur les origines de réplication et comprend :
  
  • Complexe ORC (Origin Recognition Complex) : reconnaît et marque le site d’origine.
  • Cdc6 et Cdt1 : protéines recrutées pour charger le complexe MCM.
  • Complexe MCM (Mini Chromosome Maintenance), formé des sous-unités MCM2-7, qui agit comme une hélicase.
• La séquence d’initiation est peu connue chez les eucaryotes, excepté chez la levure S. cerevisiae.
• Le complexe pre-RC est activé lorsqu’il est phosphorylé par des kinases spécifique:
  
  • CDK (Cyclin-dependent kinases).
  • DDK (Dbf4-dependent kinases).
• Cette phosphorylation libère le complexe MCM, permettant son activation.
• Ensuite, le complexe MCM s’associe à :
  
  • GINS (un complexe protéique).
  • cdc45.
• Ces associations forment le complexe actif d’hélicase qui ouvre l’ADN, permettant la progression de la fourche de réplication.
• Le complexe ORC est phosphorylé et éliminé pour permettre la fixation des ADN polymérases et le déroulement de la synthèse.

Question 13

Formation des fourches de réplication

Answer 13

• Le complexe d’hélicase actif (souvent appelé complexe CMG, pour Cdc45-MCM-GINS) forme deux fourches de réplication qui avanceront dans les deux directions à partir de l’origine.
• Ces fourches sont les sites actifs où la séparation des brins et la synthèse d’ADN se produisent.

Question 14

Protection et coordination de la fourche de réplication

Answer 14

• La fourche est stabilisée et protégée par un ensemble de protéines formant le complexe de protection de la fourche (FPC, fork protection complex).
• Ce complexe comprend :
  
  • Claspine : connectée à l’ADN polymérase ε (du brin avancé).
  • And1 : qui relie l’ADN polymérase α (qui synthétise les amorces) au complexe CMG, important pour la synthèse des fragments d’Okazaki sur le brin retardé.
  • Tim/Tipin : protéines stabilisatrices qui régulent la progression et la coordination de la fourche.
• Ce complexe permet de coordonner la synthèse simultanée des deux brins et d’éviter des problèmes comme la formation de structures secondaires ou des cassures d’ADN.

Question 15

Régulation du cycle cellulaire par les complexes Cdk/cycline

Answer 15

1. Activation séquentielle ordonnée des complexes Cdk/cycline
   
   • Les protéines Cdk (cyclin-dependent kinases) sont présentes en permanence mais sont activées uniquement lorsqu’elles s’associent à des cyclines spécifiques.
   • L’expression des cyclines dépend de l’activation préalable d’un complexe Cdk/cycline précédent, assurant ainsi une activation séquentielle ordonnée.
2. Phase G1 et point de restriction
   
   • Cycline D est induite en phase G1 et au niveau du point de restriction.
   • Elle s’associe avec Cdk4/6.
   • Ce complexe phosphoryle la protéine Rb (rétinoblastome), ce qui libère le facteur de transcription E2F (qui était séquestré par la forme non phosphorylée de Rb).
   • E2F active la transcription de nombreux gènes nécessaires à la progression du cycle, notamment :
     
     • Cycline E
     • ORC1
     • Cdc6
     • MCM-3, -5, -6
     • RPA
     • RFC
     • PCNA
     • DNA ligase
     • ADN polymérase α
     • Topoisomérase II
       (Ces protéines sont impliquées dans la formation du complexe pré-initiation et dans la réplication de l’ADN.)
3. Fin de la phase G1
   
   • Recrutement séquentiel et ordonné des protéines ORC, Cdc6, MCM2-7, Cdt1 pour former le complexe pré-réplicatif (Pre-RC).
4. Entrée en phase S
   
   • Activation du complexe Cdk2-cycline E.
   • Avec l’aide des kinases DDK, ce complexe phosphoryle Cdc6 et Cdt1.
   • Cette phosphorylation libère le complexe MCM, élimine les protéines ORC de l’origine de réplication.
   • Permet la fusion des brins d’ADN et la fixation des ADN polymérases.
   • La réplication de l’ADN peut alors commencer.
5. Progression en phase S
   
   • Le complexe Cdk2-cycline A contrôle les étapes d’élongation de la réplication.
6. Phases S, G2 et mitose
   
   • Les complexes Cdk2-cycline A puis Cdk1-cyclines A/B empêchent le réassemblage des complexes Pre-RC.
   • Ils maintiennent les protéines ORC, Cdc6 et Cdt1 hors du noyau, empêchant une nouvelle initiation de réplication avant la fin de la mitose.

Question 16

4.2. Ouverture du nucléosome

Answer 16

• Chez les eucaryotes, l’ADN est enroulé autour de nucléosomes, composés d’histones. Pour permettre la progression de la fourche de réplication, les nucléosomes doivent être temporairement dissociés.
• Cette dissociation est suivie d’une reformation rapide des nucléosomes sur l’ADN néo-synthétisé.

Question 17

4.3. Chaperones d’histones

Answer 17

• Après dissociation, les histones parentales (déjà modifiées par des marques épigénétiques) sont prises en charge par des protéines spécialisées appelées chaperones d’histones, qui les aident à se réassembler correctement.
• Les principales chaperones sont :
  
  • ASF1 (Anti Silencing Function 1) : Prend en charge les dimères d’histones H3–H4 (parentaux et néoformés).
  • FACT (Facilitates Chromatin Transcription) : Prend en charge les dimères d’histones H2A–H2B.
  • CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) : Interagit avec ASF1 et PCNA pour assembler les tétramères (H3–H4)_2.
• Ce processus assure non seulement la reformation des nucléosomes mais aussi la transmission mitotique des marques épigénétiques, qui sont importantes pour la régulation de l’expression génétique après la division cellulaire [[61]], [[62]].

Question 18

4.4. Réplication des télomères

Answer 18

• Les télomères sont les extrémités linéaires des chromosomes eucaryotes, composés de séquences répétées (TTAGGG chez l’humain).
• La réplication complète des télomères pose un problème particulier car l’ADN polymérase ne peut pas copier complètement l’extrémité 5’ du brin retardé, ce qui entraîne un raccourcissement progressif des chromosomes à chaque division.
• Télomérase :
  
  • C’est un complexe protéique spécialisé qui compense ce raccourcissement.
  • Il comprend :
    
    • Une télomérase reverse transcriptase (TERT), une enzyme ayant une activité de transcriptase inverse.
    • Une amorce ARN (TERC, telomerase RNA component) qui sert de matrice pour ajouter les répétitions télomériques.
    • Un complexe protéique d’aide à la stabilisation et au fonctionnement de la télomérase.
  • La télomérase allonge le brin simple brin 3’ des télomères en ajoutant des répétitions TTAGGG, permettant ensuite aux ADN polymérases (α et δ) de compléter la réplication de cette région.
• Cette action est cruciale pour maintenir la stabilité chromosomique et éviter la perte progressive d’ADN lors des divisions cellulaires [[63]].

Question 19

5. Cibles thérapeutiques de la réplication de l’ADN

Answer 19

La réplication de l’ADN est un processus essentiel à la division cellulaire. De ce fait, elle représente une cible majeure pour le développement de médicaments anticancéreux et d’autres thérapies qui visent à bloquer la prolifération cellulaire incontrôlée. Les agents thérapeutiques ciblent différentes étapes ou acteurs de la réplication, provoquant des dommages à l’ADN ou empêchant la synthèse correcte de l’ADN, ce qui conduit à la mort cellulaire ou à l’arrêt de la division.

Voici les principales classes d’agents thérapeutiques mentionnées :

1. Agents alkylants
   
   • Ces molécules ajoutent des groupes alkyles sur les bases de l’ADN.
   • Cela provoque la formation de liaisons covalentes anormales à l’intérieur de l’ADN (cross-linking) ou entre l’ADN et les protéines, ce qui perturbe la structure normale de l’ADN.
   • Ces altérations empêchent la réplication normale, induisent des cassures et activent les voies de réparation de l’ADN.
   • Exemples classiques : agents comme la cyclophosphamide ou le chlorambucil.
2. Agents intercalants
   
   • Ces molécules s’insèrent entre les bases empilées de l’ADN dans la double hélice.
   • En s’intercalant, elles déforment la structure de l’ADN, bloquent la progression des ADN polymérases et perturbent la réplication et la transcription.
   • Certains agents intercalants sont aussi capables d’induire des cassures dans l’ADN en association avec d’autres protéines.
3. Dommages à l’ADN et inhibiteurs de réparation
   
   • Certains agents provoquent directement des cassures ou d’autres formes de lésions dans l’ADN.
   • D’autres inhibent les enzymes de réparation, empêchant la cellule de corriger les dommages, ce qui conduit à l’accumulation de mutations fatales.
   • Cette stratégie est utile particulièrement dans les cellules tumorales qui ont souvent des défauts dans les mécanismes de réparation et sont donc plus sensibles à des inhibiteurs spécifiques.
4. Inhibiteurs de topoisomérases
   
   • Les topoisomérases sont cruciales pour gérer les surenroulements (torsions) de l’ADN qui se forment en amont de la fourche de réplication.
   • Les inhibiteurs de topoisomérases bloquent l’activité de ces enzymes, provoquant des cassures dans l’ADN et un arrêt de la réplication.
   • Par exemple, les inhibiteurs de la topoisomérase I (comme l’irinotécan) ou de la topoisomérase II (comme l’étoposide) sont largement utilisés en chimiothérapie.
5. Inhibiteurs des ADN polymérases et de la télomérase
   
   • Ces agents ciblent directement les enzymes responsables de la synthèse de l’ADN.
   • En inhibant les ADN polymérases principales (comme Pol δ et Pol ε), la synthèse d’ADN est bloquée, ce qui empêche la réplication complète du génome.
   • L’inhibition de la télomérase, enzyme essentielle à la réplication des extrémités des chromosomes (télomères), empêche le maintien de la longueur des télomères, ce qui conduit à un raccourcissement progressif et à la sénescence ou apoptose des cellules.
   • La télomérase est souvent activée dans les cellules cancéreuses, ce qui en fait une cible privilégiée.
6. Analogues de nucléotides
   
   • Ce sont des molécules ressemblant aux nucléotides naturels, mais qui, une fois incorporées dans l’ADN en cours de synthèse, provoquent un arrêt de la chaîne ou des erreurs.
   • Ils perturbent la réplication et peuvent induire des mutations ou la mort cellulaire.
   • Ces analogues sont utilisés dans des traitements antiviraux et anticancéreux.

En résumé, ces différentes classes de molécules agissent en perturbant la réplication de l’ADN à différents niveaux : altération chimique de l’ADN, blocage des enzymes clefs (topoisomérases, ADN polymérases, télomérase), ou en empêchant la réparation des dommages. Cela conduit à l’arrêt de la division cellulaire et à la mort des cellules ciblées, ce qui est particulièrement utile dans le contexte du traitement des cancers [[64]].