ExG4- Transcription bactérienne

Question 1

ARN polymérase chez les eubactéries
### Structure et composition

Answer 1

• Taille et masse :
  L’enzyme est très grande, d’environ 470 kilodaltons (kDa), ce qui correspond à une molécule massive capable d’interagir avec l’ADN et de catalyser la polymérisation des ribonucléotides.
• Sous-unités :
  Elle est composée de cinq sous-unités protéiques distinctes, organisées comme suit :
  • 2 sous-unités α
  • 1 sous-unité β
  • 1 sous-unité β’
  • 1 sous-unité ω

Chaque sous-unité a un rôle spécifique dans la fonction globale de l’enzyme.

Question 2

ARN polymérase chez les eubactéries
### Rôles des sous-unités

Answer 2

• Sous-unités α (alpha) :
  
  • Poids moléculaire d’environ 36 kDa chacune.
  • Codées par le gène rpoA.
  • Leur extrémité C-terminale (CTD) est importante pour reconnaître des éléments promoteurs spécifiques appelés éléments « up » situés en amont du promoteur.
  • Elles peuvent aussi interagir avec des activateurs de la transcription, comme la protéine CAP (Catabolite Activator Protein), facilitant ainsi la régulation génétique.
• Sous-unité β (bêta) :
  
  • Poids d’environ 151 kDa, codée par le gène rpoB.
  • Contient le site catalytique qui réalise la formation des liaisons phosphodiester entre les nucléotides d’ARN.
  • Son extrémité C-terminale est essentielle pour la fixation du facteur σ, qui guide la polymérase vers les promoteurs spécifiques.
• Sous-unité β’ (bêta prime) :
  
  • Poids d’environ 155 kDa, codée par le gène rpoC.
  • Chargée positivement grâce à des acides aminés basiques, cette sous-unité a une forte affinité pour l’ADN.
  • Elle possède un motif en doigt de zinc dans son extrémité C-terminale qui aide à maintenir le brin d’ADN non transcrit séparé du brin transcrit pendant la transcription.
• Sous-unité ω (oméga) :
  
  • Petite sous-unité de 11 kDa, codée par le gène rpoZ.
  • Elle agit comme une chaperonne, c’est-à-dire qu’elle aide à l’assemblage correct des autres sous-unités pour former un complexe fonctionnel.

Question 3

ARN polymérase chez les eubactéries
### Fonctionnement global

Answer 3

• L’enzyme couvre environ 70 à 80 paires de bases d’ADN lorsqu’elle est engagée dans la transcription.
• Une cellule bactérienne typique contient environ 7000 molécules d’ARN polymérase.
• À tout moment, 5000 à 6000 de ces enzymes sont actives en train de transcrire l’ADN en ARN.
• L’activité polymérase se fait dans le sens 5’ vers 3’, synthétisant l’ARN par ajout successif de ribonucléotides.
• Le taux de synthèse est d’environ 25 à 75 nucléotides par seconde, ce qui est adapté à la rapidité de croissance bactérienne.
• L’ARN polymérase possède des activités correctrices intrinsèques qui limitent les erreurs lors de la transcription ; le taux d’erreur est faible, environ 1 erreur pour 10 000 nucléotides incorporés.

Question 4

ARN polymérase chez les eubactéries
### Particularité chez E. coli

Answer 4

• Chez la bactérie modèle Escherichia coli, il n’existe qu’une seule ARN polymérase qui assure la transcription de tous les types d’ARN.
• Cette ARN polymérase forme ce qu’on appelle le « core enzyme » (enzyme de base) composé des sous-unités α2ββ’ω.
• Pour initier la transcription spécifique d’un gène, cette enzyme s’associe à un facteur σ, formant l’« holoenzyme », capable de reconnaître les promoteurs.

En résumé, l’ARN polymérase bactérienne est un complexe enzymatique multi-sous-unités, hautement spécialisé pour transcrire l’ADN en ARN avec une grande efficacité et fidélité. Chaque sous-unité joue un rôle précis, que ce soit dans la catalyse, la reconnaissance de l’ADN, l’assemblage du complexe ou l’interaction avec des facteurs régulateurs.

Question 5

a) Rôle général du facteur σ

Answer 5

• La core enzyme de l’ARN polymérase (composée des sous-unités 2α, β, β’, ω) est capable de se fixer sur l’ADN, de se déplacer par diffusion, et de se dissocier, mais elle ne peut pas reconnaître spécifiquement les promoteurs.
• La reconnaissance spécifique des promoteurs est indispensable pour initier la transcription au site correct (le +1) et dans la bonne direction.
• C’est là que le facteur σ intervient : en s’associant à la core enzyme, il forme l’holoenzyme (ARN polymérase complète avec capacité de reconnaissance spécifique).
• Le facteur σ permet donc à l’ARN polymérase de reconnaître les séquences spécifiques des promoteurs, d’initier la transcription au bon endroit, et de s’assurer que la synthèse d’ARN démarre dans la bonne orientation.

Question 6

b) Variétés de facteurs σ chez E. coli

Answer 6

• E. coli possède une famille de facteurs σ, chacun spécialisé pour activer la transcription de différents groupes de gènes selon les conditions environnementales :
  
  • σ70 : facteur σ primaire, responsable de la transcription des gènes « de ménage » en conditions normales.
  • σ38 : intervient en phase stationnaire (stress nutritionnel).
  • σ32 : active les gènes de choc thermique (Heat Shock).
  • σ54 : impliqué dans la régulation de l’azote.
  • σ28 : contrôle les gènes des flagelles.
  • σ20 : un autre facteur σ alternatif.
• Ces facteurs σ alternatifs permettent à la bactérie d’adapter rapidement son programme transcriptionnel selon les besoins.

Question 7

c) Facteurs anti-σ

Answer 7

• Il existe aussi des facteurs anti-σ qui régulent l’activité des facteurs σ.
• Par exemple, en phase stationnaire, le facteur anti-σ70 (appelé Rsd chez E. coli) inhibe σ70.
• Cela permet à σ38 de s’associer plus facilement à l’ARN polymérase et de diriger l’expression des gènes spécifiques à la phase stationnaire.
• Ce mécanisme assure un changement efficace de la machinerie transcriptionnelle selon les phases de croissance ou les stress.

Question 8

d) Reconnaissance des séquences promotrices par le facteur σ

Answer 8

Le facteur σ contient plusieurs régions fonctionnelles qui interagissent avec des séquences spécifiques du promoteur. Deux régions principales sont essentielles :

1. Région σ4.2 (page [[99]])
   
   • Cette région possède un motif hélice-coude-hélice classique qui reconnaît la boîte -35 du promoteur.
   • La reconnaissance se fait par des interactions précises :
     
     • Une hélice interagit avec les bases d’ADN dans le grand sillon via des liaisons hydrogène, permettant une reconnaissance spécifique des séquences.
     • L’autre hélice interagit avec le squelette sucre-phosphate de l’ADN, stabilisant la fixation.
   • Cette interaction fixe l’ARN polymérase sur le promoteur à la position -35.
2. Région σ2.4 (page [[100]])
   
   • Cette région ne possède pas de motif hélice-coude-hélice, mais des acides aminés aromatiques qui reconnaissent la boîte -10 (TATAAT typique).
   • Elle joue un rôle crucial pour initier l’ouverture locale de l’ADN (dénaturation locale) :
     
     • Les acides aminés aromatiques forment une poche hydrophobe qui interagit avec les bases qui sont retournées sur le brin non transcrit.
     • Cette interaction favorise la séparation des brins d’ADN autour du site +1, formant la bulle de transcription.
   • Cela permet à l’ARN polymérase de commencer la synthèse d’ARN.

Question 9

e) Synthèse et spécificité du facteur σ

Answer 9

• Grâce à ces interactions spécifiques avec les boîtes -35 et -10, le facteur σ permet que l’ARN polymérase reconnaisse précisément le promoteur, démarre la transcription au bon endroit, et évite la transcription non spécifique.
• Cette spécificité est cruciale pour la régulation fine de l’expression des gènes selon les besoins cellulaires.

Question 10

a) Formation du complexe fermé (RPc)

Answer 10

• L’ARN polymérase holoenzyme (core + facteur σ) se lie au promoteur de l’ADN sans encore ouvrir la double hélice.
• Le promoteur contient des séquences spécifiques, notamment les boîtes -35 et -10 en amont du site de départ (+1).
• À ce stade, les interactions entre la polymérase et l’ADN sont faibles, ce qui rend ce complexe instable.
• L’ADN reste donc sous forme de double brin non séparé (promoteur fermé).
• Cette étape sert à positionner la polymérase au bon endroit sur l’ADN.

Question 11

b) Isomérisation vers le complexe ouvert (RPo)

Answer 11

• Le complexe fermé subit une transition appelée isomérisation.
• Lors de cette étape, l’ADN est localement dénaturé (séparation des deux brins) sur environ 14 paires de bases autour du site +1, formant la bulle de transcription.
• Cette ouverture permet l’accès du brin matrice (brin antisens) à la polymérase.
• Le facteur σ joue un rôle clé dans cette ouverture, notamment par son domaine σ2.4 qui interagit avec la boîte -10 et facilite le retournement des bases (ex. bases A à -11 et T à -7 sont retournées).
• Des changements conformationnels de la polymérase et du facteur σ (repliement de l’ext N-terminale du σ, fermeture de la mâchoire formée par les sous-unités β et β’) participent à ce processus.
• La polymérase s’enroule partiellement autour de l’ADN pour stabiliser ce complexe ouvert.

Question 12

c) Synthèse initiale d’ARN et pause d’initiation

Answer 12

• La polymérase commence à synthétiser un court ARN (~6-9 nucléotides).
• Cependant, une boucle du facteur σ appelée σ3.2 bloque physiquement la sortie de cet ARN naissant, ce qui peut provoquer une pause ou une initiation abortive (arrêt de la synthèse et libération de ce court ARN).
• Ce phénomène est un contrôle qualité ou un “test” avant le passage à l’étape suivante.

Question 13

d) Transition vers l’élongation

Answer 13

• Lorsque l’ARN naissant atteint environ 16 nucléotides :
  
  • Il y a rupture des interactions entre la région σ4 du facteur σ et la boîte -35 du promoteur, ainsi qu’avec le domaine β de la polymérase.
  • Cette rupture permet la libération partielle de la polymérase du promoteur, un processus appelé départ ou promoter clearance.
  • La polymérase quitte le promoteur pour commencer l’élongation proprement dite, en synthétisant l’ARN en continu.

Question 14

Schéma résumé :

Answer 14

1. RPc (complexe fermé) : polymérase liée au promoteur, ADN double brin fermé.
2. Isomérisation : ouverture locale de l’ADN autour du +1, formation de la bulle de transcription (RPo).
3. Synthèse initiale : courte ARN synthétisé, parfois pause ou abortive à cause de σ3.2.
4. Départ : rupture des interactions σ4/β et avec le promoteur, polymérase démarre l’élongation.

Question 15

a) Mécanisme catalytique de l’élongation

Answer 15

• L’ARN polymérase possède une structure dynamique qui lui permet d’ajouter des nucléotides un par un à l’extrémité 3’ de l’ARN naissant.
• Un élément clé de cette dynamique est la boucle « trigger » (boucle déclencheuse), une structure mobile à l’intérieur de la polymérase.
• Lorsque le prochain nucléotide triphosphate (NTP) entre dans le canal II de l’enzyme, il est aligné par complémentarité des bases avec le brin matrice d’ADN.
• Un ion Mg²⁺ est associé au NTP, jouant un rôle catalytique essentiel dans la formation de la liaison phosphodiester.
• La boucle trigger change de conformation pour replier le canal II et positionner précisément l’extrémité 3’OH de l’ARN naissant en face du phosphate α du NTP entrant.
• Cette positionnement permet la réaction de polymérisation : une attaque nucléophile du 3’OH de l’ARN naissant sur le phosphate α du NTP, formant une nouvelle liaison phosphodiester et libérant un pyrophosphate.

Question 16

b) Translocation et avancée de l’ARN polymérase

Answer 16

• Après cette addition, la polymérase doit avancer (translocation) sur l’ADN pour permettre l’incorporation du nucléotide suivant.
• Cette translocation implique un changement de conformation notamment dans la sous-unité β’ :
  
  • La « bridge » hélice dirige l’extrémité 3’OH de l’ARN.
  • La boucle trigger en hélice s’ouvre pour permettre l’entrée du prochain NTP.
• Cette dynamique est essentielle pour la processivité de la polymérase — sa capacité à synthétiser de longs ARN sans se détacher.

Question 17

c) Régulateurs protéiques de l’élongation

Answer 17

Plusieurs protéines s’associent à l’ARN polymérase durant l’élongation pour moduler sa stabilité, sa vitesse et la terminaison :

• NusA :
  
  • Se lie à l’ARN polymérase après l’initiation.
  • Induit des pauses dans la transcription en stabilisant la formation de structures secondaires en tige-boucle dans l’ARN naissant.
  • Ces pauses ralentissent l’élongation et stimulent la terminaison intrinsèque (régulation fine de la durée et du moment d’arrêt).
• NusG :
  
  • Entre en compétition avec le facteur σ pour son relargage.
  • Stabilise le complexe d’élongation en renforçant les interactions entre la polymérase et l’ADN.
  • Cela rend l’enzyme plus processive (moins de dissociations intempestives).
  • Plus tard, NusG interagit avec la protéine ρ pour induire la terminaison dépendante de ρ.
• NusB/NusE :
  
  • Hétérodimère se liant à l’ARN naissant.
  • Crucial pour une transcription processive.
  • L’interaction entre NusE et NusG permet aussi de coupler la transcription à la traduction en recrutant les ribosomes sur l’ARNm en cours de synthèse.
• Protéine ρ :
  
  • Facteur de terminaison qui s’associe tôt à la polymérase.
  • Hélicase ATP-dépendante qui provoque la dissociation de la transcription à la fin du gène.

Question 18

d) Correction des erreurs durant l’élongation

Answer 18

• L’ARN polymérase possède des activités correctrices intrinsèques pour assurer la fidélité de la transcription :
  • Correction pyrophosphorolytique :
    
    • Réaction inverse de la polymérisation où l’enzyme peut retirer le dernier nucléotide ajouté en présence de pyrophosphate (PPi).
  • Correction hydrolytique :
    
    • La polymérase peut reculer (backtracking) de quelques nucléotides.
    • Elle clive ensuite les nucléotides erronés grâce à son activité endonucléolytique.
    • Cette activité est stimulée par les facteurs GreA et GreB, qui facilitent le clivage et la reprise correcte de la synthèse.

Question 19

e) Gestion des contraintes topologiques

Answer 19

• L’avancée de la polymérase génère des surenroulements positifs en aval (enroulement trop serré) et des surenroulements négatifs en amont (enroulement trop lâche) de l’ADN.
• Pour éviter que ces contraintes topologiques n’entravent la progression de la transcription, des topoisomérases interviennent :
  
  • Topoisomérase I : enlève les surenroulements négatifs.
  • Topoisomérase II (gyrase) : introduit des surenroulements négatifs pour compenser les surenroulements positifs.

Question 20

1. Terminaison rho-indépendante (intrinsèque) ([[110-111]])

Answer 20

• Ce mécanisme ne nécessite pas de facteur protéique spécifique (comme Rho).
• La terminaison repose sur des séquences spécifiques présentes dans l’ARN naissant.
• Ces séquences sont caractérisées par :
  
  • Une séquence palindromique qui peut former une structure en épingle à cheveux (tige-boucle) dans l’ARN. Cette épingle à cheveux provoque une déformation et une instabilité du complexe ARN polymérase-ARN-ADN.
  • Une succession de uridines (poly-U) sur le brin transcrit (ARN). Cette séquence riche en U forme des liaisons A-U faibles avec l’ADN matrice, ce qui facilite la dissociation de l’ARN de l’ADN.

Mécanisme :
- L’épingle à cheveux se forme dans l’ARN naissant peu après sa sortie de la polymérase.
- Cette structure rigide provoque un arrêt temporaire de la polymérase.
- La faible stabilité des liaisons A-U dans la région poly-U favorise le détachement de l’ARN.
- Résultat : dissociation simultanée de l’ARN, de l’ARN polymérase et de l’ADN, terminant la transcription.

Question 21

2. Terminaison rho-dépendante ([[112]])

Answer 21

• Ce mécanisme nécessite la protéine Rho.
• Rho est une protéine hexamérique ayant des activités ATPase et hélicase.
• Elle reconnaît une séquence spécifique sur l’ARN appelée site rut (Rho utilization site), une séquence riche en C et pauvre en G, non traduite.

Mécanisme :
- Rho se lie au site rut sur l’ARN naissant.
- Grâce à son activité ATPase, Rho hydrolyse l’ATP pour se déplacer le long de l’ARN vers la polymérase.
- En arrivant à la polymérase, Rho utilise son activité hélicase pour séparer l’ARN de l’ADN matrice et/ou déstabiliser le complexe ARN polymérase-ARN-ADN.
- Cela provoque la libération de l’ARN polymérase, de l’ARN et de l’ADN, mettant fin à la transcription.

Question 22

Régulation de la transcription chez les eubactéries

Contexte général ([[114]])

Answer 22

• Les bactéries sont des organismes unicellulaires avec des temps de génération très courts.
• Elles doivent donc s’adapter rapidement à des changements dans leur environnement, notamment la disponibilité des nutriments.
• La régulation de la transcription est un point de contrôle majeur, car elle détermine quels gènes sont exprimés en fonction des conditions externes.
• La transcription et la traduction sont couplées dans le même compartiment cellulaire.
• La majorité des ARNm bactériens ont une demi-vie courte (quelques minutes), ce qui permet une adaptation rapide.
• Les stratégies principales de contrôle de l’initiation de la transcription sont :
  
  • Le contrôle constitutif via les différents promoteurs reconnus par les facteurs σ alternatifs.
  • Le contrôle régulé par des protéines régulatrices, qui peuvent être des activateurs ou des répresseurs.

Question 23

a) L’opéron lactose (catabolique) ([[115-117]])

Answer 23

• Représente un exemple classique d’opéron catabolique.
• Phénomène de diauxie : lorsque deux sucres sont présents (ex. glucose et lactose), la bactérie utilise d’abord le glucose, puis, après son épuisement, elle active les gènes nécessaires pour utiliser le lactose.
• Cette utilisation séquentielle se traduit par une courbe de croissance biphasique.
• L’opéron lactose contient les gènes LacZ, LacY, LacA codant pour des enzymes impliquées dans la métabolisation du lactose.
• Régulation négative : Le répresseur LacI, sous forme tétramérique, se lie à l’opérateur de l’opéron lactose, bloquant la transcription en absence de lactose.
• Régulation positive : En absence de glucose, le taux d’AMP cyclique (AMPc) augmente, ce qui permet la fixation du complexe CAP-AMPc sur le promoteur, activant fortement la transcription.
• En présence de glucose, la faible concentration d’AMPc empêche cette activation.

Question 24

b) L’opéron arabinose ([[118-119]])

Answer 24

• L’opéron arabinose est un autre opéron catabolique régulé de manière plus complexe.
• Le gène araC code une protéine AraC qui agit à la fois comme répresseur et activateur selon les conditions.
• L’opéron comprend plusieurs régions régulatrices : le promoteur P_BAD contrôlant l’expression des gènes araB, araA et araD, et le promoteur P_araC contrôlant l’expression de araC.
• En absence d’arabinose :
  
  • AraC se lie aux sites araO2 et araI1, formant une boucle d’ADN qui empêche la fixation de l’ARN polymérase sur les promoteurs, bloquant la transcription (régulation négative).
• En présence d’arabinose et absence de glucose :
  
  • AraC change de conformation en se liant à l’arabinose.
  • Elle libère le site araO2 et se lie préférentiellement aux sites araI1 et araI2.
  • Cette configuration permet à l’ARN polymérase de se fixer au promoteur P_BAD et d’initier la transcription.
  • Parallèlement, le complexe CAP-AMPc se fixe également renforçant l’activation.
• Il existe aussi un mécanisme d’auto-régulation : AraC peut inhiber la transcription de son propre gène araC en se liant au promoteur P_araC quand elle est en excès.

Question 25

c) **L’opéron tryptophane (anabolique)** ([[121-124]])

Answer 25

- Exemple typique d’opéron anabolique, qui code pour des enzymes impliqués dans la biosynthèse du tryptophane. - **Régulation négative** : Le répresseur TrpR est produit sous une forme inactive (apo-répresseur) en absence de tryptophane. - En présence de tryptophane, celui-ci se lie à TrpR et active le répresseur. - Le complexe TrpR-tryptophane se fixe alors au promoteur de l’opéron, bloquant la transcription (régulation négative). - **Atténuation** : mécanisme complémentaire où la transcription est prématurément terminée en fonction de la disponibilité du tryptophane, grâce à une interaction couplée entre la transcription et la traduction. - **Inhibition en feedback** : Le tryptophane inhibe aussi l’activité enzymatique (enzyme 1 codée par TrpE/D), créant un rétrocontrôle négatif supplémentaire.