Quali sono le caratteristiche generali della SPETTROMETRIA di MASSA e cosa può analizzare?
La SPETTROMETRIA di MASSA è una tecnica analitica che:
1) Può ANALIZZARE COMPOSTI
–> ad alto/basso peso molecolare con intervallo di MW fino a centinaia di kDa
2) Ha SENSIBILITA’ più ALTA possibile al giorno d’oggi, nell’ordine delle PICOMOLI fino alle atto moli
- vede anche tracce minimi in campioni complessi come il plasma
3) VELOCE acquisizione dei dati
4) Può essere interfacciata con METODI SEPARATIVI ULTRA-PERFORMANTI per minimizzare la diffusione
5) Offre alta/bassa RISOLUZIONE
Quali sono le FASI della SPETTROMETRIA di MASSA e quali sono i suoi OBIETTIVI principali?
Le FASI dello spettrometro di massa sono:
1) IONIZZAZIONE e frammentazione
2) SEPARAZIONE di ioni –> rapporto MASSA/CARICA
3) RILEVAZIONE
Gli OBIETTIVI della spettrometria di massa sono:
- Identificare la STRUTTURA di BIOMOLECOLE
- Stabilire la SEQUENZA di POLIMERI
- Analizzare METABOLITI dei FARMACI
ma anche
- Dosare DROGHE d’abuso
- Determinare COMPONENTI di MISCELE organiche
- Analizzare sostanze INQUINANTI AMBIENTALI
Quali sono i COMPONENTI principali di uno SPETTROMETRO di MASSA?
I COMPONENTI principali di uno spettrometro di massa sono:
1) Sistema di INTRODUZIONE del CAMPIONE
2) Sorgente o CAMERA di IONIZZAZIONE
3) ANALIZZATORE
4) RILEVATORE
5) Sistema di ELABORAZIONE DATI
Come funziona il processo di IONIZZAZIONE nel sistema di introduzione del campione?
Il processo di ionizzazione nel sistema di introduzione del campione funziona come segue:
1) Il CAMPIONE è SPRUZZATO da un CAPILLARE all’interno di una CAMERA
2) Nella camera viene creata una DIFFERENZA di POTENZIALE che genera IONI + e -
3) Gli IONI NEGATIVI vengono ESCLUSI tramite una lastra di metallo carica positivamente chiamata “REPELLER”
4) Si forma un FLUSSO IONICO che va verso l’ANALIZZATORE
Cosa sono le modalità di IONIZZAZIONE “HARD” e “SOFT” e quali sono le loro applicazioni?
Le modalità di ionizzazione si distinguono in:
1) HARD IONIZATION:
- Ionizzazione ELETTRONICA (EI)
- Estremamente POTENTE e NON si utilizza per molecole biologiche
2) SOFT IONIZATION:
- Ionizzazione ELETTROSPRAY (ESI) = nei lab. analisi
- MALDI = desorbimento laser assistito da matrice, usato per fare BOIOTIPIZZAZIONI RAPIDE
NB: la ionizzazione soft è stata sviluppata negli anni ‘90 per analizzare PEPTIDI e PROTEINE, molecole più FRAGILI che non reggono una ionizzazione elettronica.
Come funziona la ionizzazione ELETTROSPRAY (ESI)?
La IONIZZAZIONE ELETTROSPRAY elettrospray (ESI) è una tecnica di ionizzazione in FASE LIQUIDA a PRESSIONE ATMOSFERICA funziona nel seguente modo:
1) Il campione arriva da una COLONNA HPLC con una FASE MOBILE POLARE
2) Il campione viene IONIZZATO in una CAMERA con struttura CAPILLARE a cui è applicata una DIFFERENZA di POTENZIALE di 5 kV (campo elettrico)
3) Le GOCCE IONIZZATE vengono sparate nel VUOTO a pressione atmosferica
4) L’ACQUA nelle gocce EVAPORA, concentrando gli ioni fino a un’ESPLOSIONE COULOMBICA che rilascia gli ioni
5) Gli ioni rilasciati raggiungono il RILEVATORE
CARATTERISTICHE dell’ESI:
- Ionizzazione delicata ADATTA per molecole di POLARITA’ MEDIO-ALTA
- Analizza composti dino a 150000 kDa
- Spesso si formano ioni con carica multipla
- Comune la presenza di ioni addotto (possono sia dare indicazioni sulla composizione che complicare l’interpretazione)
Come funziona il Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)?
Il MALDI funziona nel seguente modo:
1) I CAMPIONI vengono CARICATI su una PIASTRA CONDUTTIVA con numerosi pozzetti
2) Viene AGGIUNTA una MATRICE per coprire i campioni
3) Il LASER colpisce la MATRICE, che ASSORBE e RILASCIA lentamente l’ENERGIA al materiale biologico
- Le PULSAZIONI del LASER (10^6-10^10 W/cm2) provocano l’EVAPORAZIONE e IONIZZAZIONE del complesso matrice-campione
- Si crea un MICROPLASMA di ioni e molecole neutre che possono reagire in fase vapore
Il PROCESSO MALDI si svolge in TRE FASI principali:
1) CARICAMENTO –> il campione e la matrice vengono miscelati e asciugati
2) IRRAGGIAMENTO –> il laser estrae e ionizza il campione
3) ANALISI –> gli ioni vengono analizzati nello spettrometro di massa
Quali sono i TIPI di ANALIZZATORI utilizzati nella spettrometria di massa e come funziona l’analizzatore a QUADRUPOLO?
I principali TIPI di ANALIZZATORI utilizzati nella spettrometria di massa sono:
- A deflessione magnetica o singola focalizzazione
- A doppia focalizzazione
- A quadrupolo
- A trappola ionica
- A tempo di volo (TOF)
- A risonanza ionica ciclotronica in trasformata di Fourier (FTICR)
L’analizzatore a QUADRUPOLO ha 4 BARRE di metallo (poli) disposte parallelamente. L’ANALISI osserva il moto degli ioni tra queste barre con campi elettrici continui e alternati a intensità variabile.
- Applicando SPECIFICI VALORI di TENSIONI, solo ioni con il m/z selezionato attraversano l’analizzatore
Cosa si intende per “TRANSIZIONE” nella spettrometria di massa e perché è importante?
La “TRANSIZIONE” si riferisce alla serie di AGGIUSTAMENTI di INTENSITA’ e di energia necessari per FAR PASSARE SOLO le MOLECOLE di INTERESSARE attraverso i quadrupoli.
- La transizione è SPECIFICA per OGNI MOLECOLA –> trovata la transizione di una molecola, si stende un protocollo con i suoi valori, usato in DIAGNOSTICA per cercare specifiche molecole legate a patologie
- La transizione è utile per AUMENTARE la SPECIFICITA’ e la SENSIBILITA’ –> permette di cercare molecole specifiche in miscele complesse
Come funziona l’analizzatore A TEMPO DI VOLO (TOF) e quali sono le sue applicazioni?
L’analizzatore a TEMPO DI VOLO (TOF) funziona nel seguente modo:
1) Sfrutta l’energia del raggio LASER e la presenza di una MATRICE che protegge dal calore il materiale biologico
2) Gli ioni vengono DESOLVATI e ACCELERATI ad un’ENERGIA CINETICA COSTANTE
3) Gli ioni vengono FOCALIZZATI all’interno di un “TUBO DI VOLO” in cui viene creato il VUOTO
4) Il TEMPO IMPIEGATO a percorrere il “tubo di volo” è trasformato nel valore di MASSA dello ione in base alla relazione: Ecin=mv^2/2
APPLICAZIONI:
includono l’analisi di proteine e peptidi, specialmente in combinazione con la tecnica MALDI, permettendo l’analisi di molecole ad alto peso molecolare con alta sensibilità e risoluzione (vedi microbiologia).
Come funziona il RIVELATORE in uno spettrometro di massa?
Il RIVELATORE in uno spettrometro di massa funziona nel seguente modo:
- Trasforma l’ENERGIA prodotta dalla COLLISIONE degli ioni sulla sua superficie in segnali misurabili
- La COLLISIONE degli ioni provoca l’EMISSIONE di altri ioni, elettroni o fotoni, MISURATI da opportuni rivelatori di luce o carica
La QUANTITA’ dei SEGNALI è direttamente proporzionale al NUMERO degli IONI che colpiscono la superficie del rilevatore –> PICCHI
Permette l’ANALISI QUANTITATIVA di sostanze, confrontando il segnale della sostanza di interesse con quello di uno STANDARD INTERNO aggiunto al campione!
Cosa si intende per RISOLUZIONE nella spettrometria di massa e perché è importante?
La RISOLUZIONE nella spettrometria di massa si riferisce alla capacità dello strumento di DISTINGUERE tra PICCHI VICINI nello spettro.
È IMPORTANTE per le seguenti ragioni:
- Consente di fornire una MASSA ACCURATA
- Aumenta la certezza di una CORRETTA IDENTIFICAZIONE
- Fornisce informazioni QUALITATIVE in miscele complesse
CALCOLO:
–> M/ΔM, dove M è il valore di m/z del picco e ΔM è la differenza tra i valori di m/z di due picchi adiacenti.
Cosa si intende per SELECTED Reaction Monitoring (SRM) e MULTIPLE Reaction Monitoring (MRM)?
1) SELECTED Reaction Monitoring (SRM):
–> tecnica altamente SPECIFICA e SENSIBILE per il monitoraggio di SINGOLE MOLECOLE all’interno di un campione biologico complesso (approccio TARGETED)
Utilizza un TRIPLO QUADRUPOLO:
- Q1: ISOLA la MOLECOLA di interesse (precursore)
- Q2: FRAMMENTA i precursori di interesse
- Q3: SELEZIONA gli ioni prodotti in base al rapporto m/z
2) MULTIPLE Reaction Monitoring (MRM):
–> È praticamente l’applicazione della Selected RM a PIU’ MOLECOLE contemporaneamente
- Richiede la conoscenza delle TRANSIZIONI di CIASCUN IONE da ricercare, ma permette di stabilire la composizione molecolare del campione in una sola analisi
NB: SRM e MRM aumentano il limite di determinazione di peptidi scarsamente abbondanti di oltre 100 volte
Quali sono le CARATTERISTICHE ANALITICHE dei saggi SRM?
Le CARATTERISTICHE ANALITICHE dei saggi SRM includono:
1) SENSIBILITA’ (limite di quantificazione, LOQ)
- ~ 50 copie negli estratti di cellule intere di lievito senza frazionamento
- 0,3-1 ug/mL nel plasma umano senza frazionamento
- <10 copie/cellula (teorico) nella cellula di lievito con l’uso di un peptide standard
- 1-10 ng/mL in fluidi biologici con deplezione tramite scambio ionico forte
- 0,1-1 ng/mL in fluidi biologici con immunoprecipitazione per l’isolamento di una glicoproteina
2) SPECIFICITA’
–> permette la distinzione di ISOFORME e MUTAZIONI di SINGOLI AMMINOACIDI
Quali sono i VANTAGGI della spettrometria di massa in TANDEM (MS/MS) nel laboratorio analisi?
La SEPTTROMETRIA di massa in TANDEM (MS/MS) offre numerosi vantaggi nel laboratorio analisi:
- Può essere abbinata a TECNOLOGIE SEPARATIVE
- Può maneggiare sia CAMPIONI SOLIDI che LIQUIDI
- Può utilizzare diverse tecniche di IONIZZAZIONE adattandole al tipo di campione
- Può PRODURRE IONI positivi, negativi, multi-carica
- Può SEPARARE IONI in base alla loro massa
- Può studiare le proprietà specifiche di uno ione
- HIGH-TROUGHPUT, costi bassi, elevata qualità
Quali sono le ALTERNATIVE per la PREPARAZIONE del campione nella spettrometria di massa?
Le ALTERNATIVE per la preparazione del campione includono:
1) DILUIZIONE del campione e INIZIONE DIRETTA (“Dilute ‘n shoot”):
- Analisi diretta dopo diluizione del campione
- Nessun costo aggiuntivo
2) PRECIPITAZIONE PROTEICA:
–> Recupero del SURNATANTE e caricamento in LC-MS
3) ESTRAZIIONE LIQUIDO-LIQUIDO:
- Aggiunta di un SOLVENTO ORGANICO IMMISCIBILE al campione di SIERO/plasma
- RECUPERO della FASE ORGANICA
- EVAPORAZIONE e RICOSTITUZIONE con un SOLEVNTE COMPATIBILE con la spettrometria di massa
4) Estrazione in fase solida (SPE):
Utilizzo di un particolato (fase solida) che ritiene l’analita di interesse
Eluizione e recupero dell’analita
Quali sono le APPLICAZIONI CLINICHE di LC-MS/MS e perché viene utilizzata?
Le APPLICAZIONI CLINICHE di LC-MS/MS includono:
- Dosaggio di IMMUNOSOPPRESSORI in sangue intero
- Dosaggio di 25-OH vitamina D3/D2 in plasma/siero
- Dosaggio di STEROIDI in plasma/siero/Dry Blood Serum
LC-MS/MS viene utilizzata per:
- Sviluppo di nuovi metodi analitici
- Sostituzione di metodi preesistenti
Si ricorre alla spettrometria di massa quando si presentano problematiche, tra cui:
- DIFFICOLTA’ nell’identificare uno specifico analita
- Presenza di INTERFERENTI nel metodo analitico
- COSTI ELEVATI dei reagenti per le analisi
- TEMPI LUNGHI di analisi
- Tecnologie OBSOLETE
Perché il MONITORAGGIO TERAPEUTICO dei FARMACI (TDM) è importante nel caso degli IMMUNOSOPPRESSORI?
Il MONITORAGGIO terapeutico dei farmaci (TDM) è importante nel caso degli IMMUNOSOPPRESSORI per le seguenti ragioni:
1) Il RANGE TERAPEUTICO è RISTRETTO, quindi il dosaggio deve essere controllato in modo opportuno
2) Ogni paziente presenta ALTA INDIVIDUALITA’ per ASSORBIMENTO e DISTRIBUZIONE del farmaco
3) Per verificare la COMPLIANCE del paziente (vedere se sta prendendo il farmaco)
4) Permette di definire un INDICE TERAPEUTICO considerando fattori critici come:
- Età, sesso, peso del paziente
- Dosaggio del farmaco
- Farmacocinetica
- Co-medicazioni
- Metodiche usate dal lab. per misurare i farmaci
Quali sono i VANTAGGI dell’uso di LC-MS/MS nel dosaggio degli immunosoppressori rispetto all’IMMUNOASSAY?
I VANTAGGI dell’uso di LC-MS/MS nel dosaggio degli immunosoppressori rispetto all’immunoassay sono:
- NON ha INTERFERENZE con metaboliti o con anticorpi endogeni, da fattori reumatoidi, etc.
- è il GOLD STANDARD
- ALTA SPECIFICITA’ per ogni farmaco
- Le selezioni della massa e dei frammenti sono caratteristici per ogni farmaco
- ELIMINA ogni CROSS-REACTION con i metaboliti
- ACCURATEZZA e precisione sono largamente superiori
- Ha SENSIBILITA’ ELEVATA (0.5 ug/L)
Come viene DOSATA la VITAMINA D e quali sono i vantaggi dell’uso della SPETTROMETRIA di massa?
Il DOSAGGIO della VITAMINA D viene effettuato misurando il 25-OH-VITAMINA D3, che è il miglior marker. Le metodiche a confronto sono:
1) IMMUNOASSAY:
- Ha BIAS: non misura gli epimeri e non distingue tra D2 e D3
- Ha RANGE RIDOTTI di sensibilità e linearità
2) HPLC (cromatrografia liquida):
- Ha SENSIBILITA’ MAGGIORE ma NON è AUTOMATIZZATO
3) HPLC con SPETTROMETRIA di MASSA (HPLC-MS):
- SENSIBILITA’ ALTISSIMA, copre l’INTERO SPETTRO di variazione di concentrazione di vitamina D (1 ug/L)
- Riesce a SEPARARE gli EPIMERI (spettrometria di massa) e DISTINGUERE tra vitamina D2 e D3
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DOLCI - 1) Diabete19
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DOLCI - 2) Epatopatie18
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DOLCI - 3) Elettroliti e Acido-Base18
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DOLCI - 4) Gammopatie Monoclonali15
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DOLCI - 5) Malattia Renale20
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DOLCI - 6) Malattie Gastro-Intestinali e Pancreatiche17
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DOLCI - 7) Malattie Osso18
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DOLCI - 8) Neoplasie Maligne18
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DOLCI - 9) Rischio Cardiovascolare16
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Dolci - 10) Sindrome Coronarica Acuta15
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