Intra Flashcards

Question

sels utilisés pour la précipitation de protéines

Answer 1

- «chaotropiques» (agent de désordre) : la nature du sel est très importante; les sels qui se lient et interagissent directement avec la protéine peuvent avoir un effet déstabilisant - «kosmotropique» (agent structurant) : les sels optimaux sont ceux qui encouragent l’hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéine sans avoir aucune interaction avec la protéine - les anions multivalents comme le sulfate, le phosphate et le citrate avec des cations comme le potassium, le sodium et l’ammonium sont préférés. • le sel utilisé le plus couramment en précipitation de protéines est le sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 en raison de sa force ionique élevée et une solubilité élevée (3.9 M dans H2O à 0˚C)

Answer 2

- Hofmeister a montré, en 1888, que certains ions favorisent la précipitation des protéines à haute concentration (salting out) alors que d’autres favorisent leur solubilisation à faible concentration (salting in) Favorisent la précipitation: Anions fortement hydratés et Cations faiblement hydratés Favorisent la solubilité: Anions faiblement hydratés et Cations fortement hydratés

Answer 3

Les protéines seront éventuellement toutes précipitées par une teneur en sel assez élevée, mais certaines d'entre elles seront remarquablement résistantes (myoglobine) alors que d'autres précipiteront très facilement. C'est cette différence de solubilité qui permet de les séparer.

Answer 4

- les protéines sont constituées de nombreux groupes ionisables possédant des pKa différents - chaque protéine possède un point ou pH isoélectrique où il y a autant de charges + = - négatives -> la charge nette de la protéine = 0 - au pH isoélectrique, une protéine à tendance à devenir moins soluble: une protéine avec une charge globale nette près de zéro minimise la répulsion électrostatique et permet aux forces électrostatiques locales de prédominer menant ainsi à une attirance entre les molécules à agrégation à précipitation - précipitation isoélectrique: permet de purifier une protéine sélectivement en amenant le pH au point isoélectrique de cette protéine

Answer 5

- l’addition d’un solvant miscible avec l’eau, comme l’éthanol ou l’acétone, à un mélange contenant des protéines diminue leur solubilité - le pouvoir de l’eau de solubiliser une macromolécule chargée décroît avec la concentration du solvant organique dans la solution - ceci serait attribuable à une réduction de la constante diélectrique de l’eau - constante diélectrique: pouvoir de solvatation de l’eau pour des ions dissous (comme les protéines) - l’agrégation est provoquée par l’interaction entre des régions possédant des charges opposées - un facteur qui détermine la solubilité dans un solvant aqueux/organique est la taille de la protéine: plus grande est la protéine, plus basse est la concentration en solvant organique nécessaire afin de la précipiter -Diminution de l'hydratation de surface et augmentation de la surface hydrophobe favorisant l'agrégation comme le dessalage.

Answer 6

- Phase mobile: le mélange de substances à fractionner - Phase stationnaire (matrice): au travers laquelle les substances sont séparées. - les interactions des différentes substances avec la phase stationnaire ralentissent plus ou moins leur migration au travers de cette phase selon les propriétés respectives de chaque substance

Answer 7

- les propriétés communément utilisées pour effectuer le fractionnement sont : A. La charge –> Chromatographie par échange d’ions (IEC) B. La taille -> Chromatographie par filtration sur gel (SEC) C. L’activité biologique ou la spécificité -> Chromatographie d’affinité (AC) D. L’hydrophobicité (ou solubilité) -> Chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC)

Answer 8

les ions liés par force électrostatique à un support solide insoluble (phase stationnaire) sont remplacés de manière réversible par des ions - échangeur d’anions: support solide porte des groupes chargés + - échangeur de cations: porte des groupes chargés - - les protéines portent à la fois des charges + et - et peuvent lier à la fois un échangeur d’anions ou de cations - l’affinité dépend: 1) du pH de la solution, puisque la charge nette des protéines varie selon le pH 2) de la nature et des concentrations des autres ions en solution, qui vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions

Answer 9

- les échangeurs d’ions utilisés en chromatographie des protéines dépendent de 2 caractéristiques importantes: - La nature de leur matrice. - Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine - les matrices utilisées en chromatographie sont des polymères insolubles préparés sous formes de billes (résines) - les polymères le plus souvent utilisés sont des polysaccharides (cellulose ou des dérivés, de l’agarose ou autres polymères) - des perles céramiques rigide (silice) sont aussi utilisées - Ces polymères sont suffisamment poreux pour permettre la pénétration d’une protéine et le réseau des pores génère une surface beaucoup plus large que la surface de l’extérieur de la bille

Answer 10

- les échangeurs d’ions exploitent la présence d’une charge nette sur la protéine à un pH donné qui leur permettent d’interagir par attraction électrostatique - il y a deux classes d’échangeurs : les échangeurs anioniques: charge positive les échangeurs cationiques: charge négative - chaque classe d’échangeurs se divise « échangeur fort »: pleinement chargé entre pH ~ 3 et ~ 10 « échangeur faible »: chargé dans une gamme de pH plus restreint

Answer 11

QAE - amine quaternaire - (N+ pKa ~ 9,5) : échangeur anionique fort sulfonates : échangeur cationique fort (pKa ~ -7) DEAE - amine tertiaire - partiellement chargé à partir de pH 7 à 8 : échangeur anionique faible CM - carboxyméthyle - pleinement chargé à partir de pH 4,5 : échangeur cationique faible

Answer 12

A. Équilibration: consiste à équilibrer la phase stationnaire aux conditions de départ souhaitées. B. Chargement de l’échantillon et lavages: consiste à appliquer l'échantillon et à effectuer un lavage. L'objectif: lier la ou les molécules cibles et de laver tout le matériel non lié. Le tampon de chargement et de lavage est généralement le même que celui d’équilibration . C. Élution: Les conditions de tampon de la phase mobile sont modifiées afin d'éluer les protéines liées. Des fractions sont collectées de façon successive. D. Régénération: Un dernier lavage avec un tampon désigné régénère la colonne et élimine toutes les molécules encore liées. Cela garantit que la pleine capacité de la phase stationnaire est disponible pour la prochaine exécution.

Answer 13

- les protéines se lient aux échangeurs par des forces électrostatiques entre la surface de la protéine et les groupements chargés sur l’échangeur - les charges de l’échangeur sont contre balancées par des contre-ions (ions métalliques, des ions de sel, ou des ions du tampon). - Une protéine doit alors déplacer les contre-ions pour s’attacher, la protéine doit posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle doit déplacer - le pH et la concentration saline de la solution dans laquelle la protéine est dissoute: sont choisis de sorte que cette protéine se trouve immobilisée sur l’échangeur d’ion : UNE UNITÉ DE pH DE PLUS QUE PI

Answer 14

- une fois que la solution de protéines est appliquée sur le haut de la colonne contenant l’échangeur, la colonne est lavée avec une solution tampon - les différentes protéines se lieront à l’échangeur d’ions avec des affinités différentes • affinité faible pour l’échangeur d’ions migreront plus rapidement • plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration sera retardée

Answer 15

Séparation de plusieurs protéines par chromatographie d’échange d’ions élution fractionnée/par paliers (différents [sels], faible à fort) - élution par gradient (gradient d’élution fractionnée ou gradient linéaire) - un gradient linéaire permet de libérer, les unes après les autres, les différentes protéines liées à l’échangeur d’ions - normalement le KCl ou le NaCl sont utilisés pour former des gradients; - le sel déplace directement la protéine; les ions occupent les sites chargés devenus disponibles et bloquent le rattachement de la protéine

Answer 16

- utilisée pour éliminer les sels présents dans un échantillon de protéines - séparer les molécules selon leurs tailles grâce à l’utilisation de membranes semi-perméables - les membranes utilisées sont à base de cellophane (cellulose) • différentes grosseurs de sac pour différents volumes d’échantillons • La taille des pores dicte la limite d’exclusion des protéines (MWCO - molecular weight cut off). - d'accélérer le processus: changer souvent le tampon de dialyse pour du tampon neuf - La vitesse de dialyse dépend: qt. de matériel à dialyser, qt. du tampon et la viscosité des solutions.

Answer 17

- Centrifugation sur colonne-filtre – une forme de dialyse - Utilise une membrane poreuse pour séparer les protéines selon leur poids moléculaire La taille des pores dicte la limite d’exclusion des protéines

Answer 18

- avec cette technique de chromatographie, les molécules sont séparées selon leur taille et leur forme - les principes de cette méthode sont assez simples: 1) la phase stationnaire (résine) consiste en un réseau de polymères réticulé possédant des pores, fabriqué sous forme de billes 2) les pores dans les billes du gel sont suffisamment grands afin de permettre la pénétration complète des petites molécules, mais ils ne laissent pas pénétrer toutes les protéines à partir d’une certaine taille => la limite d’exclusion 3) les protéines qui ne pénètrent pas dans les pores traversent la colonne plus rapidement que les protéines retenues dans les pores des billes

Answer 19

polymères insolubles à base de polysaccharides préparées sous la forme de billes réticulées (poreuses): le dextrane (Sephadex) (limites d’exclusion de 0,8 à 800 kDa) l’agarose (Sépharose) (jusqu’à 40 000 kDa) de polyacrylamide (Bio-Gel), - la porosité des gels dépendra: • de la masse moléculaire du polymère • du nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules du polymère (pontages) - les meilleures billes de gel ont des tailles de pore qui excluent 90% des macromolécules qui possèdent 5 à 6 fois la taille des macromolécules retenues dans le volume interstitiel des billes –> la limite d’exclusion

Answer 20

- peut être déterminé quantitativement => c’est le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne En utilisant l’équation: Vt = Vx + Vo où Vx = le volume occupé par les billes Vo = le volume mort (volume de solvant qui entoure les billes, ~35% de Vt) Vt = le volume total de la colonne il est possible de mesurer le volume d’élution relatif (Ve/Vo) d’une protéine • Cette mesure permet d’estimer la masse moléculaire d’une protéine - il existe une relation linéaire entre le volume d’élution relatif d’une protéine et le logarithme de sa masse moléculaire

Answer 21

Technique de séparation basée sur des interactions • spécifiques • réversibles entre des molécules. - un ligand, qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt, est fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte - la protéine d’intérêt se liera au ligand immobilisé, alors que les autres protéines ne s’y lieront pas et sortiront de la colonne - récupérer la protéine désirée sous une forme très pure: modifiant les conditions d’élution: la protéine se détache du ligand - soit en ajoutant un excès de ligand libre dans la colonne - en changeant le pH, la force ionique et/ou la température - le grand avantage d’exploiter les propriétés biochimiques uniques de la protéine d’intérêt, au lieu d’utiliser des propriétés physico-chimiques qui sont aussi partagées par d’autres protéines - possède aussi l’avantage de pouvoir purifier la protéine d’intérêt à un très haut degré de pureté en une seule étape

Answer 22

- la liaison d’une protéine P à un ligand L : P+L -Kd» P-L Kd: la constante de dissociation (une mesure de l’affinité protéine- ligand) - quand le ligand est couplé à une matrice M, l’équation devient: Kd’ : P + L-M -Kd’» P-L-M - la liaison du ligand sur la matrice ne doit pas interférer dans l’interaction protéine-ligand -> le Kd’ devrait varier entre 10^-4 M et 10^-10 M - la quantité de protéine retenue sur la colonne (P-L-M) dépendra: - du Kd’ (l’interaction est trop faible si la valeur >10-4 M) - de la concentration de protéine dans l’extrait - du degré de liaison du ligand à la matrice (concentration de L-M) - La protéine ne peut pas lier le ligand lorsque ce dernier est couplé directement à la matrice d’agarose - L’ajout d’un bras espaceur de 6 atomes de carbones permet à la protéine d’avoir accès au ligand Plusieurs matrices, disponibles commercialement, possèdent des groupes réactifs, comme l’époxy séparées de la matrice par un bras espaceur

Answer 23

Étiquettes (tags) ligands: Étiquette Histine, Peptide FLAGTM, Étiquette Strep (Strep-tag; peptide), Étiquette GST (Glutathione S-transferase), Fusion à la protéine de liaison du maltose, Fusion à la protéine de liaison de la calmodulin Ligands: Ion métallique de transition, Anticorps monoclonal, Biotin, Glutathione, Amylose, Ca2+

Answer 24

- la matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité doit être: chimiquement inerte - avoir une grande porosité - présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de former des liens covalents avec les ligands • l’agarose est le polymère le plus fréquemment utilisé - la liaison par lien covalent du ligand sur la matrice d’agarose se fait en deux temps: 1) réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire "activé" et stable 2) le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par lien covalent - plusieurs protéines sont incapables de se lier à leur ligand couplé au bromure de cyanogène à cause d’interférence stérique avec la matrice d’agarose - pour éviter ce problème, un bras "espaceur" souple est ajouté entre la matrice et le ligand Synthèse de l’agarose activée par le bromure de cyanogène L’agarose activée réagit avec une amine primaire pour former un lien covalent entre un ligand (RNH2) et la matrice

Answer 25

- les méthodes utilisées sont: • absorption des protéines dans l’UV avec un spectrophotomètre: les protéines absorbent la lumière autour de 280 nm - méthode non spécifique • essai colorimétrique (essai de Bradford): contient un produit qui, en réagissant avec les protéines, donne une couleur mauve à la solution -> l’intensité de la couleur est proportionnelle à la concentration de protéine en solution - méthode non spécifique • essai enzymatique: pratique si la protéine à purifier est une enzyme • détection de la protéine sur gel SDS-PAGE (avec un colorant): permet de déterminer le degré de pureté de la protéine • détection de la protéine avec un anticorps (essai ELISA ou immunoblot) - très spécifique

Answer 26

- la migration d’un ion dans un champ électrique, est utilisée dans les séparations analytiques des molécules biologiques - Pour qu’une molécule puisse migrer dans un champ électrique, il faut que: Félectrique > Ffriction - selon les lois de l’électrostatique, la force électrique, Félectrique, sur un ion avec une charge q dans un champ électrique d’intensité, E, est: Félectrique = qE - la migration électrophorétique de l’ion à travers la solution est opposée par une force de friction: Ffriction = vf où v représente la vitesse de migration et f son coefficient de friction - le coefficient de friction donne une mesure de la résistance exercée par la solution sur l’ion pendant sa migration (dépend de la taille, de la forme de l’ion, ainsi que de la viscosité de la solution)

Answer 27

- la migration d’un ion dans un champ électrique pour les séparations analytiques des molécules biologiques - Pour qu’une molécule puisse migrer: Félectrique > Ffriction - selon les lois de l’électrostatique, la force électrique sur un ion avec une charge q dans un champ électrique d’intensité, E, est: Félectrique = qE - la migration électrophorétique est opposée par la force de friction: Ffriction = vf, où v représente la vitesse de migration et f son coefficient de friction qui donne une mesure de la résistance exercée par la solution sur l’ion pendant sa migration - Dans un champ électrique constant, les forces que s’exercent sure l’ion s’équilibrent: qE=vf - chaque ion se déplace avec une vitesse caractérisée par une mobilité électrophorétique, µ, définie par : µ = v / E = q / f - les protéines à leur point isoélectrique (où q=0) possèdent une mobilité électrophorétique nulle -la méthode d’électrophorèse la plus couramment utilisée est celle de l’électrophorèse en zones -> l’échantillon est contraint à se déplacer dans une phase solide, comme le papier filtre, la cellulose, ou d’un gel: 1) on élimine largement l’agitation provoquée par la convection, un facteur limitant du point de vue résolution. 2) cette technique requiert une quantité faible de matériel permettant ainsi la migration des composantes en bandes discrètes.

Answer 28

- constitue la technique parmi les plus puissantes et les plus faciles à utiliser dans la séparation des macromolécules - les gels d’usage commun, l’agarose et le polyacrylamide, possèdent des pores de tailles spécifiques adaptées à la séparation des molécules à l’étude - dans cette technique, la séparation moléculaire est basée non seulement sur la mobilité électrophorétique (µ) des molécules, mais aussi sur le principe de filtration sur gel - les gels d’électrophorèse retardent les molécules de taille plus grande (ce qui est l’inverse de la filtration par gel). la migration des molécules larges est retardée par rapport aux molécules plus petites Ce phénomène s'explique par la résistance que rencontrent les molécules plus grandes lorsqu'elles tentent de traverser les pores ou la matrice du gel.

Answer 29

- aussi appelé PAGE (pour PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) - les gels sont constitués par une polymérisation radicalaire d’acrylamide et de N,N’-méthylènebisacrylamide dans un tampon, initiée par l'ajout de persulfate d’ammonium (APS - ammonium persulfate en anglais). - Ceci crée une structure tridimensionnelle de polymères réticulés. La taille des pores d’un gel est déterminée par deux paramètres principaux: 1. La quantité totale d’acrylamide présente (%T) (où T = concentration totale des monomères d’acrylamide et de bisacrylamide) 2. La quantité d’agent réticulant (%C) (où C = concentration de bisacrylamide). En augmentant ces pourcentages, la taille des pores du gel diminue. - le tampon (buffer): pH ~9 pour que toutes les protéines aient une charge - - courant continu de 100 à 200 V parcourt le gel pendant la durée de la migration - les protéines migreront vers l’anode (+) selon leur ratio charge/masse - plus le gel est long, meilleure est la finesse des bandes et la résolution

Answer 30

- afin d’augmenter la résolution et donc restreindre les protéines dans des bandes plus minces, le gel peut être modifié en utilisant deux gels dans des tampons différents: A- un gel de séparation (running gel), préparé comme le gel précédent B- un gel de concentration (stacking gel), qui surmonte le gel de séparation et qui est de plus haute porosité - le tampon du gel de concentration possède un pH ~ 2 unités de moins. - le pH du tampon dans le réservoir supérieur doit contenir un acide faible - typiquement de la glycine (pKa 9,78 et son pH est ajusté près de celui du réservoir inférieur) - quand le courant est branché, les ions du tampon du réservoir supérieur migrent dans le gel de concentration - comme les ions du réservoir supérieur rencontrent un pH inférieur à leur pKa (pH< 9.8), l’acide faible (glycine) devient neutre et électrophorétiquement immobile - ceci produit une déficience en transporteurs de charges et la production d’une haute résistance électrique, R, qui à cause un courant constant imposé, I, résulte selon la loi d’Ohms (E=IR) en un champ électrique (E) très élevé. - ce champ électrique plus fort font en sorte que les protéines migrent plus rapidement dans le gel de concentration - quand les anions atteignent le gel de séparation (où le pH est plus près du pKa de la glycine), le tampon retrouve des charges négatives. -> les protéines ralentissent vu qu’il n’y a plus de déficience en ions à cet endroit. - cet effet a comme résultat de comprimer les protéines en bandes très minces (~ 0.01 mm) et ordonnées selon leur mobilité lorsqu’elles entrent dans le gel de séparation - L’utilisation d’un gel de concentration permet de minimiser la diffusion dispersive des protéines

Answer 31

- la coloration avec le bleu de Coomassie brillant - la coloration au nitrate d’argent - autoradiographie (si les protéines sont marquées avec un isotope radioactif comme le S35 ou le C14) - ces approches vont cependant détecter toutes les protéines sur le gel. - une approche plus spécifique consiste à détecter la protéine d’intérêt avec un anticorps qui reconnaît cette protéine -> par immunobuvardage ou "Western blot"

Answer 32

- La sédimentation naturelle utilise le champ de l'accélération terrestre (champ gravitationnel) Sédimentation d’ une molécule sphérique: Si le liquide a une densité d0 et la molécule/particule a une densité de d et si d > d0 la particule va sédimenter - La centrifugation utilise le champ de l'accélération centrifuge qui permet accélérer le processus de sédimentation de particules. - exposer des échantillons à de fortes accélérations qui permettent la séparation des constituants. On peut ainsi fractionner une préparation en: A. un sédiment (ou "culot"), constitué de matériel plus ou moins solidement entassé dans le fond du tube à centrifuger; B. un surnageant qui sera le liquide résiduel au-dessus du sédiment.

Answer 33

§ plusieurs centrifugations sont effectuées, séparation s'effectue principalement selon la taille des particules. § utilisé pour la récupération de culots et l'obtention de préparations partiellement pures d'organelles sub-cellulaires et de macromolécules. § Pour étudier les organelles sub-cellulaires, il faut premièrement rompre les tissus ou les cellules afin de libérer leur contenu. Ce mélange brut de cellules fractionnées se nomme homogénat. § Un homogénat de cellules peut être soumis à une série de centrifugation de forces g et de durées croissante afin de générer des culots d'organelles partiellement purifiées. § les particules plus grosses sédimentent plus rapidement que les plus petites constituant ainsi la base de l'obtention de fractions d'organelles brutes - Chaque organite peut être identifié par certains marqueurs moléculaires

Answer 34

- Les centrifugeuses préparatives sont conçues pour la préparation d’échantillons possédant des volumes significatifs - La sédimentation peut être faite dans une solution inerte comme le sucrose ou de chlorure de césium (CsCl) dans lesquels la concentration et donc la densité augmente du haut vers le bas du rotor - Pourquoi un gradient de densité ? L’utilisation de gradients de densité augmente de façon significative le pouvoir de résolution de la centrifugeuse. Les gradients de densité ont deux applications: C - 1 Ultracentrifugation zonale ou en zones C - 2 Ultracentrifugation en gradient de densité à l’équilibre ou isopycnique

Answer 35

Cette méthode de centrifugation, aussi connue sous le nom de centrifugation isopycnique, sépare les macromolécules selon leur densité CsCl: Chlorure de césium une particule de densité spécifique sera entraînée vers le fond pendant la centrifugation jusqu'au point où la densité de la solution environnante est identique à celle de la particule. Une fois ce quasi-équilibre atteint, la durée de la centrifugation n'a aucune influence sur la migration de la particule. L’échantillon est dissout dans une solution concentrée d’une substance dense qui diffuse relativement vite comme les sels CsCl et Cs2SO4, puis est soumis à de très hautes vitesses de rotation Le fort champ centrifuge génère un gradient important de sel dans lequel les composantes de l’échantillon se retrouvent en zone de densités égales à celle de la solution de sel. La densité de la particule échantillon doit se trouver dans les limites des densités de gradient. Technique préférée pour séparer des macromolécules qui possèdent une gamme de densités.

Answer 36

permettant d’aller jusqu’à des forces de 100 000 x g à 1 000 000 x g, selon le modèle, 150 000 rpm - le comportement des macromolécules en solution, soumises au champ gravitationnel terrestre, ne démontre aucune évidence de sédimentation. - l’agitation thermique est suffisante à les garder dispersées de façon homogène en solution - c’est seulement lorsque les macromolécules sont assujetties à des accélérations énormes qu’elles commencent à sédimenter. - L’ultracentrifugeuse fut inventée en 1923 par un chimiste suédois, Theodor Svedberg (prix Nobel de chimie 1926). - Grâce à cette technique, Svedberg a pu démontrer que les protéines sont des macromolécules de composition homogène et qu’un grand nombre de protéines sont composées de sous-unités. Plus généralement, ses travaux ont permis de prouver l’existence physique des molécules. - la vitesse avec laquelle une particule sédimente dans une ultracentrifugeuse dépend de sa masse (m) - la force de sédimentation, Fsédimentation, subie par une particule de masse m est égale à la force centrifuge (FC = mω2r) qui s’exerce sur la particule moins la force due au déplacement de la solution par la particule - Le coefficient de sédimentation est analogue au coefficient de mobilité électrophorétique; sa valeur est exprimée en unités de 10-13 sec qui sont connues sous forme de Svedbergs (S).

Answer 37

permettant la centrifugation jusqu’à 40 000 x g pour des volumes de 10 à 50 mL, et à des forces moindres pour des volumes allant jusqu’à 1000 mL

Answer 38

utilisées notamment pour centrifuger des microtubes de 1,5 mL (tubes Eppendorf)

Answer 39

- séparation des particules selon leurs coefficients de sédimentation - la solution de macromolécules est déposée sous forme de couche en haut d’un gradient de densité préparé au préalable - On utilise le sucrose (= saccharose), qui est visqueux et biochimiquement inerte pour former le gradient Puisque la vitesse de sédimentation est une fonction plus sensible à la masse et la forme d’une macromolécule qu’à sa densité, l’ultracentrifugation en zones sépare les macromolécules de densité similaire selon leur masse. C’est parfait pour séparer des protéines selon leur masse! - Pendant la centrifugation, chaque molécule se déplace à travers le gradient à une vitesse largement déterminée par leur coefficient de sédimentation et donc migre comme une zone. Il faut bien sélectionner le temps et la vitesse de centrifugation pour obtenir la séparation désirée.

Answer 40

1. à godets oscillants (swing out) 2. à angle fixe 3. verticaux

Answer 41

La force centrifuge appliquée sur l’échantillon est exprimée de deux manières : 1. la vitesse de rotation, exprimée en RPM (Rotation Par Minute) 2. les RCF (« Relative Centrifugal Force »), exprimée en g. La relation entre les deux dépend uniquement du rayon du rotor utilisé. RCF=(n/1000)^2*r*11,18 r est le rayon du rotor en cm pris entre le centre du rotor et le point dans le tube où la valeur RCF est requise et n est la vitesse de rotation en RPM.

Answer 42

Propriétés physico-chimiques utilisées pour purifier les acides nucléiques - polymères dont la taille varie avec le nombre de nucléotides - composés d’une forte charge négative - adoptent une structure en double brins - très soluble dans l’eau: très chargée - peu de groupements hydrophobes - sa solubilité variera avec les conditions salines et/ou la présence de substances organiques dans l’eau - la précipitation à l’éthanol (ou isopropanol) : pour le concentrer ou changer son tampon protocole typique de précipitation d’ADN : - l’ajout de 0,25 M d’acétate de sodium et 2,5 volumes d’éthanol à une solution contenant de l’ADN - la solution est ensuite mise à -20˚C pendant au moins 30 minutes et l’ADN est récupéré par centrifugation à 10 000 rpm pendant 10 minutes à 4˚C dans une microcentrifugeuse - une certaine quantité de sels sera aussi précipitée avec l’ADN. Des lavages subséquents avec de 70% l’éthanol permettra de les enlever

Answer 43

- méthode de partition de phase dans laquelle les acides nucléiques sont retrouvés dans la phase aqueuse et les protéines, pour la plupart dénaturées, partitionnent dans le phénol, la phase plus dense, et à l’interface des deux phases. - le chloroforme est éliminé facilement par précipitation avec de l’éthanol - très fréquemment des protéases, telle que la protéinase K, sont utilisées pour dégrader les protéines et faciliter leur extraction au phénol

Answer 44

- les acides nucléiques -, elles peuvent migrer dans un gel d’électrophorèse, - Les acides nucléiques de grandes tailles pénètrent difficilement dans les gels de polyacrylamide -> ces gels sont utilisés pour la purification ou l’analyse d’acides nucléiques de quelques centaines de nucléotides seulement - On utilise habituellement les gels d’agarose pour purifier et analyser les acides nucléiques de plus grandes tailles. - ces gels, contenant de 0.5 à 2% d’agarose, permettent de séparer des fragments d’ADN de quelques centaines à plusieurs milliers de nucléotides - l’agarose est dissous dans un tampon, puis bouilli. Lorsqu’il refroidit, il polymérise spontanément (comme du Jell-O) et forme un gel - pour colorer les bandes d’ADN dans les gels d’électrophorèse, des colorants comme le bromure d’éthidium sont utilisés - ce sont des molécules aromatiques cationiques planaires qui s’intercalent entre les bases - lorsqu’elles sont intercalées, elles fluorescent plus intensément qu’à l’état libre ATTENTION: Le bromure d’éthidium est cancérigène. Les colorants GelRed, SYBR Safe, et GelGreen (et autres) sont moins cancérigènes que le bromure d’éthidium (EtBr) et permettent de détecter différentes quantités l’ADN (200 ng, 100 ng, 50 ng et 25 ng) dans le gel avec une bonne sensibilité

Answer 45

1. chromatographie par échange d’ions: puisque l’ADN et l’ARN sont de charge négative, un échangeur anionique sera utilisé. -> Surtout utilisée pour purifier des oligonucléotides 2. filtration sur gel: surtout utilisée pour déssaler des oligonucléotides (de 10 à 100 nucléotides). 3. chromatographie d’affinité: utilisé principalement pour purifier les ARNm des cellules eucaryotes. Ces ARN possèdent une queue de poly(A) à leur extrêmité 3’. -> peuvent être purifiés sur une colonne d’agarose à laquelle on a greffé une séquence de oligodT/poly(T)

Answer 46

- une méthode couramment utilisée pour purifier et séparer l’ADN est l’ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium - la densité de flottaison de l’ADN dans un tel gradient dépend de sa composition en bases selon l’équation: r = 1,660 + 0,098 X (fraction GC) - par exemple, cette technique permet de séparer l’ADN nucléaire (densité plus élevée) de l’ADN mitochondrial ou chloroplastique (densités plus faibles) - cette technique est aussi utilisée pour séparer les plasmides d’ADN de l’ADN chromosomal des bactéries

Answer 47

Optimisation de paramètres clés - La température d’hybridation des amorces doit être 5˚C en dessous de la température de fusion (Tf) des amorces - La Tf dépend de divers paramètres tels que: Ø la longueur des amorces (plus les amorces sont longues et plus la température d’hybridation est élevée) Ø leur composition en nucléotides (plus le pourcentage en nucléotides G ou C augmente et plus elle est élevée). - La Tf d’une amorce peut être calculée à l’aide de logiciels en ligne qui servent également à optimiser la séquence des amorces. - Temps de polymérisation: À 72˚C, la Taq polymérise l’ADN à une vitesse d’environ 1000 bases par minute. Il faudra donc ajuster le temps de polymérisation en fonction de la taille de l’ADN à amplifier

Answer 48

Hypophosphatasie: § maladie rare héréditaire du métabolisme et de la minéralisation osseuse § résulte de mutations au niveau du gène ALPL entraînant un manque de phosphatase alcaline (TNAP) nécessaire à la minéralisation du squelette et à la calcification des os. § les patients présentent donc une grande fragilité osseuse et des problèmes dentaires Thérapie de remplacement (2006) : développée par Philippe Crine Structure à haute résolution par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) Agoniste: fragment d’une chaîne d’anticorps qui augmente l’activité enzymatique de la protéine mutante; grand potentiel thérapeutique L’identification de ce type de modulateur ➜ passe par la mesure de l’activité enzymatique! PNPP À PNP A 405nm

Answer 49

Rôle d’une enzyme: baisser l'énergie d'activation d'une réaction chimique donnée pour accélérer la vitesse de réaction cinétique enzymatique est l’étude des paramètres cinétiques d’une enzyme par le suivi de la réaction enzymatique. Chaque réaction enzymatique est définie par un ensemble de paramètres tels que • la vitesse maximale de réaction (Vmax), • la constante de Michaelis (Km), • la température optimale et • le pH optimal. Ces paramètres sont spécifiques à la réaction entre une enzyme et un substrat et permettent de quantifier l’efficacité de la réaction.

Intra Flashcards

(73 cards)