Manipulación de genes Flashcards
técnicas de manipulación de genes
- DNA recombinante
- microinyecciones de DNA en pronúcleos
- modificación de células madre embrionaria
- transferencia de núcleo a célula somática
- CRISPR-Cas
Cómo funciona la microinyección de DNA en pronúcleos
Se introduce un transgén en un vector dentro del pronúcleo de un ovulo fecundado.
Antes de la primera división
Se implanta el ovula y crece el animal transgénico
Desventajas de la microinyección de DNA
El gen se inserta al azar
- no todos sobreviven
- el gen no se expresa suficiente
Cómo sirve la modificación CME?
- se obtiene blastómero
- inserta gen por DNA recombinante
- se inyecta el blastómero en un blastocisto y se implanta
- nace animal quimérico (por parches)
- el animal quimera se reproduce e introduce los cambios al linaje
Cómo funciona la clonación?
- Se extrae el núcleo de una célula somática del animal a clonar
- se toma un ovulo no fecundado y se le quita el núcelo
- combinas el núcleo del paso 1 y el óvulo del paso 2
- desarrolla el embrión y se implanta
- nace el clon
Qué significa CRISPR?
clustered regulary intrspaced short palindromic repeats
Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas
Qué son las proteínas Cas
proteínas asociadas a CRISPR
Qué separa a las secuencias CRISPR
protoespaciadores
secuencias adquiridas del DNA viral que infectó a la bacteria
Cómo funciona el sistema CRISPR-Cas9 en la bacteria
- Cas1 y Cas2 reconocen DNA viral, cortan un proteoespaciador y lo insertan en el conjunto CRISPR
- el conjunto CRISPR se transcribe a un pre-crRNA
- tracrRNA se complemeta con las secuencias CRISPR en el pre-crRNA y une a la Cas9
- los pares de secuencia CRISPR + proteoespaciador se separan y forman complejos crRNA:tracrDNA:Cas9
- si el crRNA se complementa con el dsDNA de un virus Cas9 corta el dsDNA viral
Cómo distingue Cas9 entre el DNA viral y DNA propio?
gracias al PAM
(protospacer adjacent motif)
secuencia de 2-6 pb que sigue al proteoespaciador en el gen viral
no esta en el conjunto CRISPR
Cas9 necesita reconocer al PAM
Cómo es que siempre hay un PAM en el objetivo de la Cas9
Cas9 trabaja con Cas1 y Cas2 para que corten el proteoespaciador adyacente a la secuencia PAM
Cómo es que siempre hay un PAM adyacente a la región que los científicos quieren cortar con Cas9
cada bacteria tiene diferentes Cas9 con secuencias PAM diferentes
Cuál es la diferencia del complejo RNP con Cas9 de la bacteria y el que usan los científicos?
- bacteria: crRNA:tracrDNA:Cas9
- científicos: sgRNA:Cas9
sgRNA: secuencia complementaria diseñada con la función de crRNA + tracrRNA
Qué aplicación se le puede dar al CRISPR-Cas9 sin modificar la Cas9
Cortar genes específicos
al reparase hay errores –> deshabilita el gen
Qué modificaciones de la Cas9 permiten diferentes aplicaciones clínicas?
deshabilita el dominio enzimático de Cas9 se añaden proteínas con otras funciones para que las guíe
- deaminasa: modifica nucleótidos –> editar codones
- factores/activadores de transcripción: promueve la transcripción
- dominio KRAB: recluta factores de represión
- proteínas fluorescentes: marca genes particulares
