Modul 3 - Biologiska läkemedel Peptider och proteiner Flashcards
(34 cards)
Biologiska läkemedel - Definition:
Biologiska läkemedel - Definition:
Ett biologiskt läkemedel är ett läkemedel som innehåller ett aktivt ämne som produceras i eller utvinns från en biologisk källa, som till exempel levande celler eller organismer. Dessa celler/organismer producerar alltså det biologiska läkemedlet (T.ex. insulin), därefter renas fram det producerade proteinet.
Subkutan injektion är den mest använda administrationsvägen för biologiska läkemedel. En begränsning med denna administreringsväg är låg injektionsvolym och därmed låg dos.
Biologiska läkemedel – Storlek, komplexitet och variabilitet:
Biologiska läkemedel – Storlek, komplexitet och variabilitet:
Biologiska läkemedel har stor molekylstorlek → Stor variation
* Små biologiska läkemedel: Peptider med 10–50 aminosyror. * Stora biologiska molekyler: T.ex. antikroppar. Dessa har hög molekylvikt och komplex 3D-struktur. * Ännu mer komplexa biologiska läkemedel: Cell- och genterapier, där man använder hela cellen. Cellterapi är en typ av biologisk LM. Man använder oftast patientens egna celler, för att minimera immunreaktioner.
Små LM är mindre i storlek och komplexitet än biologiska LM och syntetiseras på kemisk väg. Medan biologiska LM skapas ur levande celler.
Biosimilarer
Biosimilarer
* En biosimilar är ett biologiskt läkemedel som utvecklats för att vara mycket likt ett existerande biologiskt läkemedel. Detta existerande biologiska läkemedel är en medicin som redan har blivit godkänd och som används i EU, och som benämns som en referensprodukt. När patenträttigheterna för referensprodukten har gått ut får biosimilaren komma ut på marknaden.
En biosimilarer är inte identisk och har inte samma struktur (Molekylstrukturen kan skilja sig något), men har samma kliniska effekt, säkerhet och toxikologisk profil som referensprodukten. En biosimilarer produceras biologiskt (t.ex. med cellinjer) – vilket ger naturlig variabilitet.
Ibland justeras molekylstorlek eller struktur för bättre stabilitet, men utan att förändra den biologiska aktiviteten. Måste visa ingen kliniskt och toxisk relevant skillnad från referensläkemedlet.
I Sverige: Inte automatiskt utbytbara än.
Att införa utbytbarhet är viktig för att, minska kostnader.
Glykosylering av proteiner:
Glykosylering av proteiner: Glykosylering är en posttranslationell modifiering där sockermolekyler (glukosgrupper) binds till proteinet.
* Posttranslationell modifiering viktig för löslighet, stabilitet och korrekt veckning av proteinet.
- Varierande glykosyleringsmönster i olika cell-linjer, exempelvis HEK och jäst (mannos): : Beroende på cellsystem får man olika grad på glykosylering.
- Nästan ingen glykosylering i E-coli
- Glykosylering av antikroppar viktigt för funktion.
- Omkring 50% av alla humana proteiner är mer eller mindre glykosylerade.
Problem med biologiska läkemedel
Problem med biologiska läkemedel
* Biologiskt ursprung.
- Mikrobiell kontamination: Oavsiktlig förekomst av mikroorganismer under tillverkningen av biologiska läkemedel:
- Bakterier
- Mycoplasma
- Virus
- TSE (transmissible spongiform encephalopathy, dvs “galna-ko sjukan”)
- Större variabilitet (mikroorgansimer är individer).
- Strukturellt inte lika väl karaktäriserade som kemiska substanser.
- Immunologiska reaktioner: Biologiska LM kan våra kroppar reagera emot.
Grundläggande proteinegenskaper
Grundläggande proteinegenskaper
* Makromolekyl/hög molekylvikt (>5kDa): Gräns mellan peptid och protein. I läkemedelssammanhang molekyler med molekylvikt över ~5 kDa (kilodalton) för proteiner.
- Aminosyror är byggstenar - Sammanlänkade med peptidbindningar: Aminosyror har olika egenskaper, vilket ger olika egenskaper åt det biologiska LM:et.
- Substanser med 3D-struktur som behövs för biologisk aktivitet: Inte bara en långkedja, utan även ihopkopplade och veckade.
- Amfifila: Kan ha hydrofila och hydrofoba strukturer, beroende på aminosyror har de olika karaktärer. Flesta proteiner och aminosyror är lättlösliga i vatten, men det är svårt att dem få över biologiska membran.
- Specifik bindning - specifik effekt!
- Inneboende instabilitet - Förståelse för proteiners grundläggande egenskaper kan hjälpa formulering av stabila beredningar: Formuleringar är viktiga för att få proteinet stabilt. För att biologiska läkemedel ska vara stabila, krävs djup förståelse för proteinets instabilitet och optimerad formulering.
Farmaceutiska problem:
Farmaceutiska problem:
* Biofarmaci:
- Permeabilitet låg över yttre barriärer.
- Kemisk och fysikalisk stabilitet (tex pH).
- Enzymatisk aktivitet (tex proteaser): Enzymer kan bryta ner makromolekyler. Därför är nästan bara injektion möjligt och inte oral adminsteringsväg.
- Formulering av lösning - Syftet med formuleringen:
- Sterilitet / undvika mikrobiell kontaminering.
- Uppnå kemisk och fysikalisk stabilitet.
- Undvika partiklar/agglomerat: För att proteinet inte ska aggregerar eller fällas ut.
Proteinstrukturer:
Proteinstrukturer:
· Primärstruktur - Aminosyresekvens.
· Sekundärstruktur - a-helix, ẞ-sheets: Lokala veckningar i kedjan: - α-helix – Spiralform - β-sheet (β-flak) – Veckade plattor · Tertiärstruktur - Regioner i ett enskilt protein: Kedja veckar ihop sig och får bindningar mellan sig. Den fullständiga 3D-strukturen för en enskild polypeptidkedja. · Kvartärstruktur - Komplex av flera protein: När flera polypeptidkedjor (subenheter) sammanfogas till ett protein-komplex. Den kvartära strukturen är avgörande för den biologiska effekten.
Krafter som stabiliserar 3D-strukturen:
Krafter som stabiliserar 3D-strukturen:
· Alfa-Helix
· Beta-Sheets
· Di-sulfidbryggor som kan vara angreppsställe för nedbrytning eller modifiering.
· Vätebindningar: Är svaga bindningar
· Metall joner: Kan vara katalysatorer av olika kemiska reaktioner.
· Hydrofoba interaktioner: Aminosyror med hydrofoba karaktär kan integrera med varandra.
· Elektrostatisk attraktion: Mellan laddade aminosyror.
Ovannämnda krafter kan förändras med formuleringen, då de kan brytas och 3D-strukturen kan därmed förändras eller nya bindningar kan förekomma, detta kan t.ex. resultera i utfällning.
Aminosyrors egenskaper påverkar proteinets struktur, aminosyror kan ha hydrofoba eller hydrofila karaktärer. Genom att byta ut en eller flera aminosyror i proteinet kan man bibehålla den biologiska effekten, men förbättra stabilitet och minska oönskade interaktioner.
Proteiner veckas ut/denaturerar vid en specifik temperatur
Proteiner veckas ut/denaturerar vid en specifik temperatur (Tm – melting temp):
Denaturering = Förlust av proteinets naturliga 3D-struktur (veckning) → Proteinet blir inaktivt.
Äggvita denaturerar irreversibelt vid kokning – Kan inte återgå till flytande (Vid 100°C).
Man kan förskjuta denatureringstemperaturen för ett protein uppåt genom att använda olika salter i formuleringen vid tillverkningen.
→ Förskjuta denatureringstemperaturen till en högre nivå → Göra läkemedlet stabilt i rumstemperatur eller vid hantering.
Proteiners amfifila struktur:
Proteiners amfifila struktur:
* Aminosyror har hydrofila och hydrofoba egenskaper vilket skapar hydrofoba och hydrofila regioner i proteinet:
- Mest hydrofobisk aminosyra —> Isoleucine CH3CHCH(CH3): Kolväte
- Standard/medium aminosyra —> Glycine H
- Mest hydrofila aminosyra —> Arginine NH2CNH2+NH(CH2)3
Detta kan användas för att ändra i aminosyra sekvens och därmed egenskaper hos proteinet.
Proteiners löslighet
Proteiners löslighet
· Isoelektrisk punkt: IP är det pH där ett protein har nettoladdning = 0. När de har ingen laddning eller dess laddning tar ut varandra. Laddningspotential är 0. Totalt laddning är 0.
* Insaltning/utsaltning.
* Preferentiell interaktion/ hydrering av co-solvent.
De flesta proteiner är lösliga i vatten.
Isoelektrisk punkt (IP):
Isoelektrisk punkt (IP):
* Olika aminosyror, olika syra och basfunktioner med olika pKa: IP beror på aminosyrornas pKa-värden.
- Isoelektrisk punkt (IP): Ingen nettoladdning på hela proteinet → Minimum i löslighet ⇔ Lösningen ska vara mer än ±1 pH enhet från IP.
Vid IP → minsta löslighet (Proteinet tenderar att aggregera eller fällas ut). Därför bör formulerings-pH ligga minst ±1 pH-enhet från IP för att öka lösligheten. - pH 4-7 ofta nödvändigt för att undvika hydrolys (och för att vara biokompatibelt): Formulering ska har surare för att minska risk till hydrolys.
Insaltning/Utsaltning:
Insaltning/Utsaltning:
S/S0 förehållande är beroende på mängd salt som tillsättas, då salt kan antigen öka eller minska löslighet av ett protein i en formulering.
Praktisk användning av insaltning/utsaltning:
Salt kan används för att rena proteiner, då salt kan fälls ut proteiner vid olika mättnadsgrader → Fälls ut, centrifugeras, och samlas upp.
Preferentiell interaktion:
Preferentiell interaktion:
Socker och polyoler (eg. Sucrose, trehalose, laktos, mannitol, glycerol) förbättrar den fysikaliska stabiliteten under frystorkning genom preferentiell interaction.
Under frystorkningen, evaporerar vatten från proteinet → Risk att det förlorar sin 3D-struktur, då vatten håller 3D-strukturen (kollaps). För att förhindra strukturkollaps, under frystorkningen, tillsätts socker eller polyoler som ersätta vattenmolekyler runt proteinet och upprätthålla 3D-strukturen av proteinet.
Stabilitet av protein:
Stabilitet av protein:
1- Fysikalisk stabilitet:
* Denaturering
* Ytadsorption: Att proteinet binder till ytan av t.ex. glas, plast. Detta leder till minskad dos till patienten. För att undvika ytadsorption kan man mätta ytan med albumin innan man tillsätter sin lösning av protein.
OBS! Insulin har benägenhet att binda till ytor.
* Aggregering: Proteinet kan klumpa ihop sig, detta kan resultera i att de förlorar sin effekt.
* Utfällning
* Förändring i 3D-strukturen
2- Kemisk stabilitet:
* Hydrolys (deaminering)
* Oxidation
* Disulfidereduktion: Disulfid bryggor.
* Racemisering
Exempel på analytiska metoder för att analysera 3D strukturen.
Exempel på analytiska metoder för att analysera 3D strukturen. Dessa är vanliga i protein analys:
* Activity: Biological activity assay (SPR, ELISA, RIA) in vivo, in vitro.
RIA: Coat-antigen fästs på en platta. En lösning innehållande det testade proteinet → Binder till antigenet om det finns affinitet → Allt som inte bundit tvättas bort → Tillsättning av radioaktivt märkt molekyl.
* Charge: IEF (isoelectric focusing) * Size/aggregation state: SEC*, SDS-PAGE* * Purity*: HPLC, LAL, DNA hybridization, ELISA, Western blot * Concentration: A280, BCA, aminoacidanalysis * Aggregation/opalescence: visual observation, transmittance at 400-600nm (light scattering) * Solubility: Combination of various techniques * DSC, ITC (Thermochemistry methods) * Amino acid sequencing: Sekvensera aminosyror och därmed analysera vilka aminosyror sitter ihop i ett protein. * Mass spectrometry * CD * IR
Formulering av peptid/proteinläkemedel:
Formulering av peptid/proteinläkemedel:
* De flesta proteiner är marginellt stabila i lösning: Alltså att proteiner ligger nära gränsen till att denatureras, aggregera eller fällas ut – särskilt i lösning.
* Många nedbrytningsvägar.
* Många analytiska tekniker nödvändiga för att analysera stabilitet.
* Accelererade stabilitetstester är svåra att använda för att det finns många nedbrytningsmekanismer:
Exponering för olika temperaturer för att undersöka proteinets stabilitet i olika temperaturer.
Skakning av löning av proteinet som lösningen utsätts för under LM tillverkningen och användningen: Leder ofta till skumning → Denaturering (Fälla ut).
* Många proteiner bildar aggregat. * Proteiner är ytaktiva. * Steril produkt.
Formuleringsutveckling:
Formuleringsutveckling:
* Beredningsform: Vattenlösning, Frystorkad produkt: Men även suspensioner för t.ex. insulin för att ha längre frisättningstid av insulin men suspensioner av biologiska LM är inte vanliga för att problem kan förekomma.
* Val beror på testfas: Tox - enkel (frusen vattenlösning) Kliniskt test- enkel lösning (phase I): Kommersiell-fullt utvecklad formulering (fryst) * Stabilitet "bra nog" Shelf-life > 2 years, eller mindre…: Gärna över 2 års hållbarhet. * Förpackning/förvaring: Olika material som är speciallt anpassade för biologiska LM med interaktion med ytan (Ytadsorption).
Preformulering för peptider och protein:
Preformulering för peptider och protein: Information innan LM formulering:
* Löslighet.
* Proteinkoncentration, (adsorption and aggregation): Viktigt att ange hur hög koncentration kan vi ha av proteinet. Insulin uttrycks ofta i internationella enheter (IU), inte mg/ml, eftersom 1 IU insulin = Mängden insulin som krävs för att minska blodsocker (Den biologiska aktiviteten är det viktiga, inte massan). Det är därför viktigt att rena insulin utvunnen från gris (förr), men idag vi kan teoretisk gå över till mg/ml (För att man är säker i sin produktion och att mängden utespeglar aktivitet. Idag: Förbättrad produktion och formulering → Högre koncentrationer som 100 IU/ml eller till och med 500 IU/ml är möjliga. Förut kunde man inte ha höga koncentrationer på grund av brist på stabilitet (Aggregationsproblem, då det blir tätt). * pH-aktivitet, (löslighet, ytaktivitet, aggregering, hydrolys) * Saltkoncentration/jonstyrka, (löslighet, 3D-stabilitet, aggregering). * Temperatur, (TD, kemiska reaktioner). * Frys-tining: Accelererade studier. * Skakning: Accelererade studier. * Filtrering. * Adsorption till material. * Accelererade studier.
Pegylering: Polyetylenglykol (PEG)
Pegylering: Polyetylenglykol (PEG) som hjälpämne, där PEG fästas på protein och ger ökad vattenlöslighet → Vi kan öka koncentration av proteinet:
Polyetylenglykol (PEG) fästs till proteinet.
- Maskerar proteinet från immunsystemet: Ingen hot för immunsystemet → Minskad risk av eliminering av proteinet. - Minskad renal clearance: Halveringstider för biologiska läkemedel är ganska kort, genom att koppla PEG på proteinet minskas den renala utsöndringen. - Ökad vattenlöslighet: Blir mer hydrofil och ännu större, därför kan det inte hjälpa med absorptionen.
Hjälpämne:
Hjälpämne:
* Mannitol, glycine (Bulkämnen, Kakbildare): Under frystorkningsprocessen.
* PEG, socker, aminosyror, albumin (Kryopretektanter): Skydd vid frysningsprocessen med vatten kvar. När vatten fryser kan iskristaller bildas och skada proteinets 3D-struktur. * Sugars, aminoacids (Lyoprotektanter): Skydda vid att bort vatten processen. När vattnet tas bort, förlorar proteinet sitt stödnätverk av vatten → risk för kollaps av strukturen. * Inorganic & organic salts, aminoacids (pH reglerare) * Metionin, glutation (Antioxidanter) * EDTA (Är metall jonbindare för att det kan katalysera oxidationsprocessen), citrate (Komplexbildare) * Albumin (Minska ytadsorption), PS 80 (Antiadsorption) * NaCl (Isotoni)
Parabener, bensylalcohol (Konservering): Fler dos ska konserveras.
Proteiner är ofta värmekänsliga
Proteiner är ofta värmekänsliga och instabila i lösning. För att bevara deras struktur och funktion används frystorkningen. Alltså att proteiner kan inte frystorkas på samma sätt som vanligt låg molekylära LM.
Processen utnyttjar trippelpunkten i fasdiagrammet – Den punkt där ämnet kan existera samtidigt i fast, flytande och gasform.
Frystorkning sker i flera steg:
1- Proteinlösningen i början är i flytande fas, den placeras i en injektionsflaska och kyls ned i ett frystorkningsapparat tills den blir helt frusen (fast fas).
2- Trycket sänks under trippelpunkten, och temperaturen höjs. Detta gör att isen går direkt från fast fas till gas – utan att passera den flytande fasen.
Primär- och sekundär torkning:
Primär- och sekundär torkning:
* Primär torkning: är processen att omvandla is direkt till en gas utan att smälta.
* Sekundär torkning: När all is är borta finns fortfarande lite vatten kvar, bundet till materialet. I det sista steget höjer man temperaturen ytterligare (men fortfarande försiktigt), så att även detta vatten drivs ut.
