mRNA processing & Proteinsyntes hos eukaryoter

Question 1

Modifiering av RNA?

Answer 1

• Samtliga tRNA, rRNA, & mRNA modifieras efter transkription för att
erhålla en funktionell form
– initialt är storleken på RNA transkriptatet större än slutresultatet.
Detta beror på sk. leader sekvenser på 5’ änden & trailer
sekvenser på 3’ änden
– processtypen hos prokaryoter skiljer sig stort från den hos
eukaryoter, detta gäller framförallt för mRNA
• Modifieringar
– trimming av leader & trailer sekvenser (tRNA,rRNA)
– Tillägg av terminala sekvenser (mRNA)
– modifiering av strukturen på specifika baser sk. Editing
(mRNA,tRNA)

Question 2

Post-transkriptionell modifiering av

eukaryot mRNA?

Answer 2

”Processing” (bearbetning) som äger rum i cellkärnan innan mRNAt
transporteras till cytosolen:
1. 5’-capping av det primära transkriptet
2. poly-adenylering av 3’-änden (polyA-tail)
3. borttagande av introner genom splicing

Question 3

The 5’-Cap (m7G-CAP ) ??

Answer 3

• 7-methylguanosine links to 5’-
end via 5’,5’-triphosphate link.
– formed with a molecule of GTP
– may include additional methyl-
ations at 2’OH groups of next two 
nucleotides following the cap
– methyl groups derive from S-
adenosylmethionine (SAMe)
• Protects RNA from nucleases
• Forms a binding site for ribosom

CAP är som ett skydd.
Ändrat 5’ änden katalyseras av enzymer, m7-CAP gör det.
5’capping är en flerstegsreaktion

Question 4

Vad är 5’-capping?

Answer 4

5’-capping är en flerstegsreaktion.

5’-capping sker m.h.a enzymer bundna till CTD svansen på RNA pol II.

Capping sker nästan direkt efter
transkriptionsstart.

Question 5

Splicing-Exoner/Introner, Hur fungerar dessa?

Answer 5

• uttryckbara (kodande) DNA sekvenser kallas exoner
  –mellanliggande DNA sekvenser som inte uttrycks (icke-kodande) kallas introner
• Splicing (eliminering av introner) sker i
  specifika säten.

Question 6

Splicing, vad är detta ?

Answer 6

• Splicing sker i specifika sekvenser mha ett stort (60S) protein-RNA komplex=spliciosomen
• The spliceosome is made up of snRNPs
  (“snurps” for small nuclear ribonuclear
  proteins).
• GU at 5’-end and AG at 3’-end usually mark
  sites of splicing

Question 7

Binding of U1 snRNP and U2 snRNP, vad gör dessa?

Answer 7

• Contain regions complementary to mRNA
• U1 helps define the 5’-splice site.
• U2 binds near the 3’-end of the intron.
– creates a bulge that partly displaces and activates an A to be a
better nucleophile
– This A forms the 2’5’-phosphodiester bond of the lariat-like
intermediate.

Question 8

Vad behövs vid Splicing-reaktionen?

Answer 8

• Next, U2, U4, U5, and U6
bind, bringing at least 50
proteins to create a
spliceosome.

• ATP is required for assembly 
but not cleavage.
• Some parts are attached to 
the CTD (carboxy-terminal 
domain) of RNA Pol II.
– indicates coordination of 
splicing with transcription

Question 9

Polyadenylering av 3’-änden?

Answer 9

• It serves as a binding site on 
mRNA during translation and 
protects it from degradation.
• RNA Pol II synthesizes RNA 
beyond the cleavage signal 
sequence.
– The cleavage signal is bound by an 
endonuclease and a polyadenylate 
polymerase bound to CTD.
• Endonuclease cleaves RNA 
10−30 nt downstream to highly 
conserved AAUAA.
• Polyadenylate polymerase 
synthesizes 80−250 nt of A.

Question 10

Vad gör CTD-svansen?

Answer 10

kopplande av transkription och pre-mRNA processing.

Question 11

Vad kan splicing öka?

Answer 11

Alternativ splicing ökar protein-repertoaren.

• A single gene can yield different peptides depending on RNA processing.
• Particular regions may be retained or removed, yielding different mature
transcripts.
• At least 95% of human genes are alternatively spliced.

Question 12

Alternativa polyadenyleringssäten, vad finns de för vägar?

Answer 12

En eukaryot gen kan ha flera klyvnings- och polyadenyleringsäten

Det genererar större mångfald i regioner som i t.e.x de variabla domänerna av “heavy chain” på immunglobulin.

Question 13

Vad är ribozymes?

Answer 13

De är RNA Molekyler som agerar på samma sätt som enzymer.

”Katalytiskt RNA”

Question 14

tRNA genomgår omfattande modifiering, ge exempel?

Answer 14

Ex. trimning och splicing av tRNATyr från jäst

Question 15

Eukaryot translationsinitiering, skillnad vis initiering ?

Answer 15

Fokus på prokaryot translation
Men förstå skillnader i initiering!
* Cirkularisering av mRNA visar vikten av 5’-cap
och poly-A-svansen
* ej fMet utan Met på speciellt tRNA(init)
* fler IF ca 12st jmf med 3 i prok
* Ingen tydlig RBS-sekvens, mer en skanningsprocess
Dvs ingen shine-dalgarno, utan 5’-cap+polyA
Kozak indikerar start

Question 16

Eukaryot Elongering, vad har hon för faktorer ?

Answer 16

• Liknar prokaryot. (se förra föreläsningen)
• Elongeringsfaktorer– eEF1α (EF-Tu), eEF1βγ (EF-Ts),
eEF2 (EF-G)
• Skillnad: Eukaryota ribosomer har INTE ngt E-site;
oladdade tRNAs frigörs från P-site.

Question 17

Exempel för Proteintransport?

Answer 17

ex. Signal Recognition Particle för transport till endoplasmatiska retiklet

Question 18

Vad händer med defekta proteiner ? Hur fungerar det med protein hos eukaryota

Answer 18

• Defekta proteiner (felveckade) och
  proteiner med kort halveringstid
  bryts ned via en ATP beroende mekanism.

- Hos eukaryoter märks proteinet med 
ubiquitin(protein) via en 3-
stegsmekansim m.h.a 3 olika 
enzymer, E1 ubiquitin-activating 
enzyme, E2 ubiquitin-conjugating 
enzyme och E3 ubiquitin ligase.