notas imp Flashcards
1
Q
Caracteristicas que diferenciam as modificacoes epigeneticas das restantes alteracoes
A
- alt estrutura da cromatina ( e nao do dna)
- reversiveis
- padrao de metilacao mantem se na replicacao e mitoses
2
Q
delecao inframe vs frameshift
A
inframe
- ins ou del numero bases mult de 3
- delecao ou ins de alguns aa mas resto da ptn igual
frameshift
- grelha de leitura alterada
- ptn diferente a partir desse ponto
- associada a ptn truncada e a perda de funcao
nao sabemos se o aa q falta na inframe é imp ou nao mas frameshift tem um impacto funcional pior pois a ptn e toda diferente a partir do ponto onde a variante ocorre
3
Q
HAPLOINSUFICIENCIA
A
- alelo mutado da origem a perda de funcao da ptn e a ptn codificada pelo alelo normal é insuf p garantir a funcao da celula no organismo
- manif em heterozigotia
- só ocorre em genes sensiveis à dosagem genica ( nos restantes a doenca so ocorre se recessiva)
- heterogeneidade alelica frequente ( dif var em dif locais podem originar este mecanismo molecular, basta originarem perda de funcao de uma das ptn)
- ocorre por exemplo:
-nmd deteta codao stop prematuro e degrada esse mrna e 50% da ptn normal do outro alelo nao e suf
4
Q
EFEITO DOMINANTE NEGATIVO
A
- ptn mutada é nao funcional e inibe a funcao da ptn normal
- associado freq a ptn que atuam como dimeros ou multimeros
- heterozigotia, com menos de 50% ptn normal
- associada a ptn truncadas (nonsense e frameshift) mas tmb a missense em localizacoes especificas de ptn multimericas
- nao ocorre se variante consistir na delecao completa do gene ( dai a variante missense ser pior que variante nula)
5
Q
5 e 3 UTR
A
5
- extremo 5 mrna
- transcrito mas nao traduzido
- envolvido:
*mec epigeneticos
*lig aos ribossomas
*lig a ptn reguladoras
3
- ext final do mrna
- transc mas nao trad
- imp p:
*lig aos ribossomas
*eficacia da traducao e estabilidade
*ligacao a ptn reguladoras (ex: miRNA)
em ambos os locais:
- alt leva alt taxa de transcricao e na quantidade do produto
- lig a ptn na 5 inibe traducao e na 3 inibe degradacao do mrna
6
Q
NGS VS SANGER
A
- NGS maior escala (milhares de fragmentos ao mm tempo, sendo possivel estudar varios pacientes ao mm tempo)
- NGS é quantitativo, sendo possivel quantificar mosaicismos de baixa expressao ( sanger nao consegue inf a 20%)
- NGS mais indicado para casos de heterogeneidade alélica ou de locus ( custo elevado e demasiado tempo de execução no sanger)
- Sanger mais ultilizada, pe, quando já sabemos a variante causadora (em estudos familiares)
7
Q
UV e NER
A
- radiacao UV provoca dimero de pirimidinas, que leva a delecoes e apoptoses
- mecanismo de reparacao associado : NER ( que remove cerca de 30 nucleotidos) q entre outras coisas, remove dimeros
- associaco explica q mtacoes em genes do sistema NER estejam associados a cancro da pele
8
Q
%
A
15 var estruturais
+90 mC em CpG e seq DNA repetitivo
45-50 DNA repetitico
2 de STR no genoma
1-2 genoma codificante (ou seja, q forma ptn, pq muito dna é transcrito mas fica por ai)
9
Q
MUTACAO DINAMICA
A
- associadas a rep de tripletos
- quando rep passa um limiar, pode associar se a patologia
- DNA fica instavel e com tendencia p aumentar n rep das meioses maternas ( p geracao seguinte)
- 3 grupos de alelos:
*normais
*pre mutacao ( n de rep da instabilidade, pode expandir na meiose mas nao ha manif clinica) (no sexo feminino, associado falencia ovaria precoce; no sexo masculino associado a sindrome do tremor e ataxia)
*mutacao ( ha manif clinica) - expansao pode ocorrer por emparelhamento anormal por deslizamento durante replicacao
“mutacoes dinamicas sao STRs expandidos em locus especficos que atravessam um limiar de reps”
EXEMPLOS:
5 UTR - SINDROME X FRAGIL
- rep CGG em 5utr gene FMR1 (se +200 rep)
- hipermetilacao regiao reguladora
- ausencia de transcricao levando a defice de ptn
1 exao - doenca Huntigton
- doenca autossomica odminante
- rep CAG 1 exao gene HTT (patologico se mais d 36)
- forma seq poliglutamina terminal amina da ptn, ficando esta mais longa
- agregados dsa ptn no nucleo e citoplasma
- morte neuronios
- reducao peso cerebral
- !! doenca ocorre sempre por esta variante
3 UTR- distrofia miotonica tipo 1
- autossomica dominante
-CTG +50 em 3 UTR gene DMPK
-formacao estruturas na ansa da regiao expandida do mrna com aifnidade p ptn imp p splicing de outros genes
- causa sliciopatia de outros genes
10
Q
motivos para ngs nao informativo
A
- Variante não é identificada pelo tipo de protocolo (inserção ALU, mutações dinâmicas, CNV´s);
- Eliminarmos a variante com os filtros que usámos (por exemplo, variante sinónima);
- Variante causal pode estar numa região não sequenciada1 (sem cobertura ou com pouca profundidade de cobertura);
11
Q
mutacoes em regioes intergnicas podem fazer um gene distante nao se expressar
A
- há seq reguladoras com localização distante do gene (várias Kb, a montante ou a jusante do promotor principal), onde se ligam proteínas que regulam a transcrição, intensificando-a (enhancers) ou inibindo-a (silencers)
12
Q
estudos de STRs com PCR seguido de eletroforese capilar
A
- ident numero de copias de cada str em cada alelo
- med forense ( regioes nao condficantes)
- dissomia uniparental
- gel de agarose nao distingue fragmentos com pequenas diferencas de nucleotidos por isso e que esta é melhor opcao (pg 15 sebenta pratica)
13
Q
ncRNA: RNA nao codificante (exemplos)
A
-
miRNA :
-inibem traducao atraves do complexo miRISC ( associacao com ptn RISC), ligam se a ext 3 e destroiem o mRNA - LncRNA : regulacao da expressao genica nomeadamente epigenetica da transcricao,, inibindo-a
- CeRNA: transcritos não codificantes com efeito de captação/competição p miRNAs
14
Q
mecanismo molecular associado a fenotipo dominante que habitualmente nao pse associe a heterogeneidade alelica
A
- tinha pensado em huntignton mas acho q doenca nao e bem um mecanismo molceular
- talvez efeito dominante negativo porque é frequenemente causado por nonsnese e var com frameshift, podendo tmb ser missense em ptn multimericas
15
Q
como se deteta uma epimutação ( no caso, metilacao de citosinas)
A
- tratamento de dna com bissulfuto
- bissulfito de sodio reage com citosinas nao metiladas convertendo em U
- por sequenciamente, vemos quais a citosinas q estavam metiladas (continuam C) e as que nao estavam (no seq leem se T)
16
Q
2 indicacoes para RT PCR
A
- extrair o mrna de celulas q expressem o gene (nem todos os genes sao de expressao ubiquitaria)
- localizacao dos primers (p nao amplificar dna):
-em exoes dif (mrna so com os exoes, dna com introes mt longos nao e amplificado)
-entre dos exoes consecutivos ( disposicao exclusiva do mrna, no dna sao introes)
17
Q
inicio e fim:
-transcricao
-traducao
A
transcricao
- TSS (transcription starting site) até sinal poli A)
traducao
- codao iniciaçao ate codao stop
18
Q
doenca monogenica
A
- doenca causada por uma alteracao num gene especifico
- variantes raras mas com elevada penetrancia
exemplos de doencas mono na pag39
19
Q
relacao entre envelhecimento, perda de metilacao de transposoes e perde de expressao de genes supressores tumorais
A
- envelhecimento
- diminuicao da mCpG (especialmente a nivel dos transposoes)
- genoma instavel
(e neste caso em especifico)
- possibilidade de ins de um transposao perto gene supressor tumoral
- interferencia com regiao reguladora, pe, inibindo expressao do gene
20
Q
associação CNV e patologia
A
- CNV intragenico com alt n copias de grandes sequencias intragenicas (englobando um ou mais exoes e introes)
- associado a ptn truncada ou ausencia de ptn (perda de funcao)
- elevada probabilidade de serem patologicas
- freq baixa na populacao
21
Q
onde mutacoes sao mais ‘frequentes
A
regioes nao cosidifcantes
- nao sao transcritas logo nao sao reparadas c tanta freq p mec de reparacao
- acumulacao
22
Q
polimorfismos não estão sempre na origem de ptn polimórficas
A
- mts sao silenciosos
- uns ocorrem em regioes intergenicas
23
Q
perda de funcao de uma ptn associado a fenotipos dominantes ou recessivos
A
- maioritariamente a recessivos, isto pq maioria dos genes nao sao sensiveis a dosagem genica
- tmb se pode associar a dominantes (haplo e efeito dominante negativo
24
Q
ganho de funcao associado a mutacoes em genes e locus…
A
especificos (baixa heterogeneidade alelica)
25
manutencao do perfil epigenetico
**DNMT1** (manutencao)
- de manutencao
- atividade preferencial p CpG hemimetiladas
- assegura padrao de metilacao na sintese de dna q antecede a divisao celular
**DNMT3** (metilacao de novo)
- diferenciação celular
- resposta a estimulos ambientais
26
polimorfismos tem penetrancia...
**BAIXA**
- é o efeito cumulativo que causa patologia (doencas multifatoriais)
- probabilidade de uma determinar doenca é muito baixa
27
doenças multifatoriais/complexas
- doenca causada por alt em varios genes
- ambiente com papel crucial
- fenotipo complexo com variantes frequentes na populacao mas com baixa penetrancia
28
Patologia genetica
SEM PROD DE PTN MUTADA
- variante na regiao reguladora q altera taxa de transcricao
- alt quantidade da ptn
- ptn normal mas ao ser menos causa fenotipo patogenico
SEM ALT SEQ BASES
- epimutacoes
29
se a um doente com criterios para uma certa doenca nao for detetado a variante por ngs significa que a situacao familiar nao e monogenica
**FALSO**
pode ser um falso negativo
30
CpG hotspots
p metilacao e desaminacao
31
maioria das mutacoes com causa...
endogena
32
importancia dos pseudogenes
- Cópias defeituosas de genes funcionais contendo vários exões desse gene
- apresentam várias mutações comparativamente ao gene funcional que se foram acumulando ao longo da evolução da espécie humana
- num protocolo de pcr ou rt pcr e imp saber se o gene tem pseudogenes para que os primers nao os amplifiquem ( ai iriamos encontrar muitas mutacoes)
33
no cancro, inibicao da desacetilacao (OU SEJA ESTA ACETILADO) ...
permite expressao de genes supressores tumorais
34
sistema MMR
- repara erros de emparelhamento
- variantes relacionadas com erros de emparelhamentos e pequenas e medias ins e delecoes
- falencia sistema leva a erros de replicacao de microssatelites por ins ou delecao - **instabilidade de microsatelites** (ou seja, qnd celulas se replicam o n rep de str e sempre dif, sendo maior ou menor)
35
variante associada a variablidade fenotipica individual
**SNP**
- grande densidade no genoma (tem muitas localizacaoes ao longo do genoma; maioria das variantes sao snp);
- modificações simples que (podem acontecer de forma espontanea) que alteram expressao genica sem ser de forma mt drastica, nao dando patologia mas contribuindo para variabilidade fenotipica
36
características da cromatina quando a transcrição não esta ativa
- dna hipermetilado
- histonas desacetiladas
- cromatina muito condensada
37
procedimento analise p se saber se variante sinonima interfere com expressao genica
- extracao rna de cels onde é expressa
- rt pcr (p sintese do cdna atraves do rna)
- amplificar cdna p pcr
. sequenciar com sanger e comparar com controlo normal
. (ou) eletroforese p comparar tamanho dos fragmentos
38
STR mais informativo
- motivo (tem ate 10pb) repete n vezes variavel e o proprio motivo e variavel, dai existirem diversos alelos possiveis numa populacao para um determinado locus
- heterozigotia + freq que em SNP
- aplicacao, pe, med forense, testes exckusao de paternidade\
39
variante do dna pode ser causa de doenca monogenica quando localizada antes codao inicacao, depois codao stop e em regioes intergenicas?
SIM
40
o que origina uma variante em sequencias intronicas envolvidas no splicing
- retencao introes
- elimnacao exoes
- associado a framshit e ptn truncadas
41
VARIANTE
GERMINATIVA VS SOMATICA VS MOSAICO
**GERMINATIVA**
- origem num dos gametas q formou o zigoto
-presente em todas as cels do organismo
- 50 % dos seus gametas com mutacao
-50% chance de passar mutacao p descendencia
**SOMATICA**
-presente num grupo restrito de celulas (num tecido especifico)
- nenhum gameta com mutacao
-sem possibilidade de passar p descendencia
**MOSAICO**
- mutacao pos zigotica no embriao
- % diferente nos dif tecidos, podendo uns ter e outros nao
- sem motivo p estudar os pais
- probabilidade de os pais terem outro filho com a mutacao é nula
- menos de 50% dos gametas com mutacao, logo probabilidade de passar p descendencia sera sempre inferior a 50
- no gonadal, variante so existe em algumas cels germinativas, menos de 50, e so so suspeita quando um pai com gonadal, depois de varios ngs sem detetar mutacao em quakquer tecido, tem mais de um filho com a variante em heterozigotia
42
mutacao missense
- subst de uma base por outra, levando a codificacao de um aa diferente
- pode originar ganho, perda (diminuicao ou ausencia) ou nova funcao
- verificação do seu significado patológico pode não ser fácil
- para encontrar uma, se for especifica e soubermos a sua localizacao, SANGER, se for em muitos individuos, QPCR (discriminacao alelica com duas sondas TaqMan)
43
PCR com primers marcados com fluoróforos e deteção por eletroforese
capilar em sequenciador automático
. tecnica para avaliar niveis de rejeico ao transplante
- med forense (strs zona nao codif)
- teste pais
- p mutacoes dinamicas
44
na utilizacao de arrays...
- estudam se milhares de fragmentos
- nao tem a ver com estudo de genes especificos;
- caro
- justificado em casos como ver que genes estao aumentados num tecido tumoral, screening etc etc
45
neomutacoes de origem paterna
- na espermatogenese, ha muitas mitoses antes da diferenciacao em espermatezoide
- muitas opurtunidades de p ocorrer erro na formacao de dna
(problema na gametogenese feminina é a possibilidade de nao disjuncao cromossomica)
46
CNV intragenico vs CNV incluindo genes
**INTRAGENICO**
- alt n copias de longas seq intragenicas podendo engolbar um ou mais exoes e introes
- associado a ausencia de sintese de ptn ou a ptn alteradas e truncadas, com perda de funcao
**incluindo genes**
- tera alteracao a nivel da funcao se gene for sensivel a dosagem genica ( so 5-10% sao)
47
desiquilibrio da expressao alelica - mecanismos envolvidos
- variacoes da sequencia em cis q interferem com perfil epigeneto, transcriscao...
- outros mecanismos (imprinting genomico, intaivacao por parte do x...)
48
confirmacao da situacao de mosaico por diagnostico molecular?
-estudar tecido afetado e o nao afetado
-variante pode n existir em alguns tecidos
-freq da var é dif, sendo maior nos afetados
-suspeitar se freq inf a 30
-variante nao existe nos progenitores
49
Variantes sinónimas podem ser patogénicas. Porquê?
- ativar seq critica de splicing
- alt estabilidade do mrna
- alt taxa de traducao
50
sequencia do splicing
GT e AG
- extremidade do intrao
- regioes dadoras/recetoras de splicing
51
estudos GWA
- snp
- array de snp
52
caso menino com defice intelectual, podem existir cnvs grandes ou pequenas delecoes; realizou se hcg e nada... oq fazer a seguir
pcr?
53
mecanismo de reparação do dna para manter a integridade
mais utilizado
**BER**
- repara alt + freq
- cerca 20000 bases alt por dia
54
Escolha múltipla em que houve aumento da proliferação. O que pode
estar presentes em genes cancerígenos
MISSENSE
55
o que explica a diversidade celular
- cada tipo de célula tem um padrão (perfil) de expressão génica característico (regulacao da expressao genetica)
56
microrna
- pequenos rna
- nao codificantes
- transcritos por
*genes de mirna
*introes de genes de ptn ou de transcritos nao codificantes
*seq line e sine
*seq antisense de exoes de outros genes
- inibem traducoa de mrna de outros genes
57
p identificar cnv
- pcr (se em homozigotia)
- array de hcg
58
para fazer sanger precisamos de pcr
- pcr p amplificar o segmento
- confirmar que na eletroforese temos apenas uma banda, oq siginfica que todos os frgmentos amplificados sao do mm tamanho
59
imp da regulacao da expressao genica
- diferenciacao celular ( cada celula com padrao de expressao genetica)
- diversidade interindividual
60
passos da pcr
**desnaturacao**
- separar dupla cadeia
**annealing**
- ligacao dos primers
**extensao**
- sintese nova cadeia
61
cnv
numero variavel cópias de longas
sequências
62
atrofia muscular espinhal - genes modificadores
- SMN1 determina se ha ou nao patologia
- SMN2 (n copias determina gravidade da patologia)\
63
PCRs com primers marcados com
fluoróforos e a eletroforese capilar
64
