notas imp Flashcards
Caracteristicas que diferenciam as modificacoes epigeneticas das restantes alteracoes
- alt estrutura da cromatina ( e nao do dna)
- reversiveis
- padrao de metilacao mantem se na replicacao e mitoses
delecao inframe vs frameshift
inframe
- ins ou del numero bases mult de 3
- delecao ou ins de alguns aa mas resto da ptn igual
frameshift
- grelha de leitura alterada
- ptn diferente a partir desse ponto
- associada a ptn truncada e a perda de funcao
nao sabemos se o aa q falta na inframe é imp ou nao mas frameshift tem um impacto funcional pior pois a ptn e toda diferente a partir do ponto onde a variante ocorre
HAPLOINSUFICIENCIA
- alelo mutado da origem a perda de funcao da ptn e a ptn codificada pelo alelo normal é insuf p garantir a funcao da celula no organismo
- manif em heterozigotia
- só ocorre em genes sensiveis à dosagem genica ( nos restantes a doenca so ocorre se recessiva)
- heterogeneidade alelica frequente ( dif var em dif locais podem originar este mecanismo molecular, basta originarem perda de funcao de uma das ptn)
- ocorre por exemplo:
-nmd deteta codao stop prematuro e degrada esse mrna e 50% da ptn normal do outro alelo nao e suf
EFEITO DOMINANTE NEGATIVO
- ptn mutada é nao funcional e inibe a funcao da ptn normal
- associado freq a ptn que atuam como dimeros ou multimeros
- heterozigotia, com menos de 50% ptn normal
- associada a ptn truncadas (nonsense e frameshift) mas tmb a missense em localizacoes especificas de ptn multimericas
- nao ocorre se variante consistir na delecao completa do gene ( dai a variante missense ser pior que variante nula)
5 e 3 UTR
5
- extremo 5 mrna
- transcrito mas nao traduzido
- envolvido:
*mec epigeneticos
*lig aos ribossomas
*lig a ptn reguladoras
3
- ext final do mrna
- transc mas nao trad
- imp p:
*lig aos ribossomas
*eficacia da traducao e estabilidade
*ligacao a ptn reguladoras (ex: miRNA)
em ambos os locais:
- alt leva alt taxa de transcricao e na quantidade do produto
- lig a ptn na 5 inibe traducao e na 3 inibe degradacao do mrna
NGS VS SANGER
- NGS maior escala (milhares de fragmentos ao mm tempo, sendo possivel estudar varios pacientes ao mm tempo)
- NGS é quantitativo, sendo possivel quantificar mosaicismos de baixa expressao ( sanger nao consegue inf a 20%)
- NGS mais indicado para casos de heterogeneidade alélica ou de locus ( custo elevado e demasiado tempo de execução no sanger)
- Sanger mais ultilizada, pe, quando já sabemos a variante causadora (em estudos familiares)
UV e NER
- radiacao UV provoca dimero de pirimidinas, que leva a delecoes e apoptoses
- mecanismo de reparacao associado : NER ( que remove cerca de 30 nucleotidos) q entre outras coisas, remove dimeros
- associaco explica q mtacoes em genes do sistema NER estejam associados a cancro da pele
%
15 var estruturais
+90 mC em CpG e seq DNA repetitivo
45-50 DNA repetitico
2 de STR no genoma
1-2 genoma codificante (ou seja, q forma ptn, pq muito dna é transcrito mas fica por ai)
MUTACAO DINAMICA
- associadas a rep de tripletos
- quando rep passa um limiar, pode associar se a patologia
- DNA fica instavel e com tendencia p aumentar n rep das meioses maternas ( p geracao seguinte)
- 3 grupos de alelos:
*normais
*pre mutacao ( n de rep da instabilidade, pode expandir na meiose mas nao ha manif clinica) (no sexo feminino, associado falencia ovaria precoce; no sexo masculino associado a sindrome do tremor e ataxia)
*mutacao ( ha manif clinica) - expansao pode ocorrer por emparelhamento anormal por deslizamento durante replicacao
“mutacoes dinamicas sao STRs expandidos em locus especficos que atravessam um limiar de reps”
EXEMPLOS:
5 UTR - SINDROME X FRAGIL
- rep CGG em 5utr gene FMR1 (se +200 rep)
- hipermetilacao regiao reguladora
- ausencia de transcricao levando a defice de ptn
1 exao - doenca Huntigton
- doenca autossomica odminante
- rep CAG 1 exao gene HTT (patologico se mais d 36)
- forma seq poliglutamina terminal amina da ptn, ficando esta mais longa
- agregados dsa ptn no nucleo e citoplasma
- morte neuronios
- reducao peso cerebral
- !! doenca ocorre sempre por esta variante
3 UTR- distrofia miotonica tipo 1
- autossomica dominante
-CTG +50 em 3 UTR gene DMPK
-formacao estruturas na ansa da regiao expandida do mrna com aifnidade p ptn imp p splicing de outros genes
- causa sliciopatia de outros genes
motivos para ngs nao informativo
- Variante não é identificada pelo tipo de protocolo (inserção ALU, mutações dinâmicas, CNV´s);
- Eliminarmos a variante com os filtros que usámos (por exemplo, variante sinónima);
- Variante causal pode estar numa região não sequenciada1 (sem cobertura ou com pouca profundidade de cobertura);
mutacoes em regioes intergnicas podem fazer um gene distante nao se expressar
- há seq reguladoras com localização distante do gene (várias Kb, a montante ou a jusante do promotor principal), onde se ligam proteínas que regulam a transcrição, intensificando-a (enhancers) ou inibindo-a (silencers)
estudos de STRs com PCR seguido de eletroforese capilar
- ident numero de copias de cada str em cada alelo
- med forense ( regioes nao condficantes)
- dissomia uniparental
- gel de agarose nao distingue fragmentos com pequenas diferencas de nucleotidos por isso e que esta é melhor opcao (pg 15 sebenta pratica)
ncRNA: RNA nao codificante (exemplos)
-
miRNA :
-inibem traducao atraves do complexo miRISC ( associacao com ptn RISC), ligam se a ext 3 e destroiem o mRNA - LncRNA : regulacao da expressao genica nomeadamente epigenetica da transcricao,, inibindo-a
- CeRNA: transcritos não codificantes com efeito de captação/competição p miRNAs
mecanismo molecular associado a fenotipo dominante que habitualmente nao pse associe a heterogeneidade alelica
- tinha pensado em huntignton mas acho q doenca nao e bem um mecanismo molceular
- talvez efeito dominante negativo porque é frequenemente causado por nonsnese e var com frameshift, podendo tmb ser missense em ptn multimericas
como se deteta uma epimutação ( no caso, metilacao de citosinas)
- tratamento de dna com bissulfuto
- bissulfito de sodio reage com citosinas nao metiladas convertendo em U
- por sequenciamente, vemos quais a citosinas q estavam metiladas (continuam C) e as que nao estavam (no seq leem se T)
2 indicacoes para RT PCR
- extrair o mrna de celulas q expressem o gene (nem todos os genes sao de expressao ubiquitaria)
- localizacao dos primers (p nao amplificar dna):
-em exoes dif (mrna so com os exoes, dna com introes mt longos nao e amplificado)
-entre dos exoes consecutivos ( disposicao exclusiva do mrna, no dna sao introes)
inicio e fim:
-transcricao
-traducao
transcricao
- TSS (transcription starting site) até sinal poli A)
traducao
- codao iniciaçao ate codao stop
doenca monogenica
- doenca causada por uma alteracao num gene especifico
- variantes raras mas com elevada penetrancia
exemplos de doencas mono na pag39
relacao entre envelhecimento, perda de metilacao de transposoes e perde de expressao de genes supressores tumorais
- envelhecimento
- diminuicao da mCpG (especialmente a nivel dos transposoes)
- genoma instavel
(e neste caso em especifico)
- possibilidade de ins de um transposao perto gene supressor tumoral
- interferencia com regiao reguladora, pe, inibindo expressao do gene
associação CNV e patologia
- CNV intragenico com alt n copias de grandes sequencias intragenicas (englobando um ou mais exoes e introes)
- associado a ptn truncada ou ausencia de ptn (perda de funcao)
- elevada probabilidade de serem patologicas
- freq baixa na populacao
onde mutacoes sao mais ‘frequentes
regioes nao cosidifcantes
- nao sao transcritas logo nao sao reparadas c tanta freq p mec de reparacao
- acumulacao
polimorfismos não estão sempre na origem de ptn polimórficas
- mts sao silenciosos
- uns ocorrem em regioes intergenicas
perda de funcao de uma ptn associado a fenotipos dominantes ou recessivos
- maioritariamente a recessivos, isto pq maioria dos genes nao sao sensiveis a dosagem genica
- tmb se pode associar a dominantes (haplo e efeito dominante negativo
ganho de funcao associado a mutacoes em genes e locus…
especificos (baixa heterogeneidade alelica)
manutencao do perfil epigenetico
DNMT1 (manutencao)
- de manutencao
- atividade preferencial p CpG hemimetiladas
- assegura padrao de metilacao na sintese de dna q antecede a divisao celular
DNMT3 (metilacao de novo)
- diferenciação celular
- resposta a estimulos ambientais
