RESUMO TECNICAS BIOLOGIA MOLECULAR

Question 1

PCR (polimerase chain reaction)

Answer 1

QUALITATIVO

• pcr multiplex: permite-nos amplificar diferentes sequências de DNA, desde que utilizemosdiferentes pares de primers.
• se for com primers marcados com fluoforos e detecao por eletroforese capilar, fica uma tecnica mais sensivel, maior limiar de resolucao e permite estudo de varios snv
• permite o estudo de apenas uma celula
• NAO VÊ VARIACOES PONTUAIS PQ N ALT O COMP DO SEGMENTO

VARIAVEIS IDENTIFICADAS
- delecoes/duplicacoes/insercoes (n mt grandes mas maiores q limiar minimo do gel) (atraves da diferenca de comprimento dos segmentos amplificados)
- grandes delecoes em homozigotia (ausencia de amplificacao)
- presenca de seq especifica de dna (atraves de primers especificos para essa sequencia)
- identiicacao de STR. mutacoes dinamicas
- base p outras tecnicas

VANTAGENS:
- facilidade
- sensibilidade
- rapidez
- especificidade

DESVANTAGENS:
- temos de conhecer a seq a estudar
- limite da extensao do fragmento
- amplificacao inespecififca
- dificuldades de otimizacao
- nao permite avaliacao quantitativa fidedigna
- contaminacao

PRIMER MARCADO COM FLUOFOROS E DETEÇÃO POR ELETROFORESE CAPILAR EM SEQUENCIADOR AUTOMATICO
- util p STR, mutacoes dinamicas e outras variantes associadas a alteracao de comprimento de sequencia

Question 2

RT-PCR

Answer 2

APLICACOES
-avaliar expressao genica
-identificao de infecao por virus de rna
-avalair efeito de variantes geneticas sobre o splicing

CENAS BACANAS
-podemos estudar varios exoes porque rna nao tem introes
-temos de escolher celulas q expressem esse gene

Question 3

PCR e TR-PCR em tempo real

Answer 3

• quantidde de fluorescencia depende essencilmente da quantidasde inicial de dna e do n de ciclos

QUANTITATIVA

VANTAGENS
-+ sensivel
-sem necessidade de eletroforese
- menos risco de contaminacao
-avaliacao quantitativa

APLICACOES RT PCR (p quantificar…)
-expressao genica
-transcritos marcadores tumorais
-expressao de microrna
-quantificar cargas virais

APLICACOES qPCR
-quantificar n copias de gene ou variante de dna
- discriminacao alelica ( duas sondas com fluoforos diferntes, uma para cada alelo), possivel de usar numa escala populacional mas os primers tem de ser especificos)

Question 4

PCR DIGITAL

Answer 4

+sensivel
+ facil contaminacao
util p biopsia liquida

Question 5

SEQUENCIACAO DE SANGER

Answer 5

QUALITATIVA
-determinar ordem das bases de fragmento de dna ou rna (cnda)
-1 primer de cada vez (le uma cadeia de cada cez)
- tem como base a aplificacao da sequencia alvo por pcr

APLICACOES
-confirmar resultados de outras tecnicas
-pesquisas variantes causas unicas
-sequencias cdna p ver efeito de var intronica no splicing
-identifificar polimr«orfismois especificos

LIMITACOES
- n adequado casos de heterogeneidade alelica ou de locus
- n identifica grandes duplicacoes ou delecoes em heterozigotia (nao e quant)
- baixa sensibilidade, so deteta mutracoes se presentes + 20 %

Question 6

NGS (nova geração)

Answer 6

qualitativa e quantitativa
- maior escala q sanger
- estuda simultâneo mts doentes
- baixo custo
- teoricamente identifica todas variaveis (porem pode nao conseguir identificar cnv nem outras estruturais

VANTAGENS
-ident mosaicismos de muito baixa expressao
-quantif mosaicismos

DIFICULDADES
- selecao da variante causal (possibilidade de um falso negativo)
- n identifica maioria das variantes estruturais
- nao identifica variantes em exoes com baixa cobertura
- raramente identifica mutacoes dinamicas, cnvs, retrotrasposoes (maioria das estruturais)
- em caso de exoma, nao identifica variantes fora dos exoes

RAZOES P RESULTADOS FALSOS NEGATIVOS
- ma filtracao
- variante numa regiao sem cobertura
- tipo de variante n ident (mutacoes dinamicas etc)
- variante com significado clinico incerto

Question 7

ARRAYS

Answer 7

quantitativo por excelencia
-cobertura genomica

1) SNP
-sondas q variam apenas numa posicao
-pode caract milhares de SNP em simultaneo
- estudos de associacao p odentificar alelos de suscetibilidade de doenca

2) HGC
-ident grandes deles/duplicacoes de localizacao desconhecida
- n ident anomalias estruturais cromossomicas equilibradas

3) de expressoa genica
-estuda variacoes de expressao dos genes

Question 8

OPTICAL GENOME MAPPING

Answer 8

-deteta variacoes estruturais com alt equilibradas
- identificaca varios tipos de variantes estruturais pela ordem, posicao e orientacao das sondas