Tecniche della biologia molecolare Flashcards
Quali sono le proprietà degli acidi nucleici?
- Spettro di assorbimento (assorbimento UV molto alto)
2. Denaturazione del DNA (legami H tra basi complementari ed interazioni idrofobiche)
Cosa può determinare la denaturazione del DNA?
Alta T, alto pH, agenti chimici (es. urea)
Cos’è la temperatura di melting?
È la temperatura alla quale avviene metà della transizione ipercromica (ossia metà della denaturazione)
DNA ricco in A:T avrà Tm più bassa
DNA ricco in C:G avrà Tm più alta
(foto)
Cos’è l’ibridazione?
Doppia elica costituita da un filamento di DNA ed uno di RNA con sequenze complementari. Si deve operare a T<25 °C della Tm della doppia elica da ricostruire per evitare che si riassocino sono filamenti perfettamente complementari. le sequenze semplici riassociano più facilmente
Come si studia la compatibilità tra due filamenti per l’ibridazione?
Parametri per definire velocità riassociazione = cot
Il contenuto C+G è direttamente proporzionale a T e indica quanto il DNA è stabile
(foto)
Perché la curva di riassociazione degli organismi eucariotici non è perfettamente sigmoidale come quella dei procarioti?
Per la presenza di DNA altamente ripetitivo, DNA mediamente ripetitivo, DNA unico e DNA satelliti
Come avviene la separazione elettroforetica?
Nell’eletroforesi su gel la matrice solida è costituita da agarosio e gel policrammide
Se sottoposto a campo magnetico, le molecole di DNA ed RNA migrano in funzione di carica, dimensione e struttura. Essendo carichi negativamente per la presenza di gruppi fosfato migrano dal catodo all’anodo.
Si costruisce una scala logaritmica che permette di estrapolare differenti frammenti.
I frammenti separati vengono visualizzati immergendo il gel in una soluzione con EtBr
Perché si usa l’EtBr nella separazione elettroforetica?
È una molecola intercalante, si inserisce tra le basi usando le interazioni di Staking.
È potenzialmente mutageno e tossico perché in grado di oltrepassare la membrana cellulare
Nell’elettroforesi migra più velocemente una molecola di DNA circolare rilassata o superavvolta?
La superavvolta, perché è più compatta
Cos’è la sonda di DNA?
È usato per la riassociazione di filamenti all’interno di una popolazione eterogenea; le sequenze bersaglio sono fissate su un supporto che viene fatto reagire con la sonda in soluzione.
Supporto costituito da speciali filtri.
