Tema 5: EMBRIÓN

Question 1

1. DIAGNÓSTICO PREIMPLANTACIONAL

Answer 1

Permite conocer algunas de las características del embrión para estimar su valor y rentabilidad

Incluso permite conocer características indeseadas y descartarlo automáticamente

Determinamos : Genotipo y Fenotipo

Question 2

1. DIAGNÓSTICO PREIMPLANTACIONAL
   1.1 DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO (SEXO)
   - Tecnicas y explicación

Answer 2

Siempre se produce un daño severo al embrión al hacer la BIOPSIA EMBRIONARIA (¡Cuantas más células se extraigan mayores daños se producen!)
1. Embrión en fase mórula :
muestra de algunos
blastómeros
2. Embrión en fase blastocisto:
se recogerán fibras del
trofoectodermo

Técnicas:
1. ESTUDIO DE CARIOTIPO.
- Para conocer el sexo
- Elevado nº de cel necesario
- Las células recogidas se
encontrarán en una
fase específica de ciclo
celular
- Se para la fase
- Ordenar los cromosomas
según el número de
la especie
- XX y XY

2. PCR.
   
   • Se determinan fragmentos
     especif. del ADN del
     cromosoma
   • Menor nº cel necesarias
   • Los blastómeros sometidos a
     una reacción electroforética
     -> desplazamiento de las cél
     al ser sometidas a un campo
     magnético.
   • Los machos dibujan un
     patrón de bandas que en
     hembras aparece ausente.
3. HIBRIDACIÓN IN SITU.
   - Menor nº cel necesarias
   - Se emplea para la
   localización, detección y
   marcaje
   - Mediante tinciones
   fluorescentes de secuencias
   de ADN concretas.
   - Cromosoma Y con
   fluorescencia verde ->
   aparecerá mayor
   fluorescencia machos >
   hembras en estas
   regiones de ADN.

Nº células: cariotipo > PCR > hibridación in situ

Question 3

1. DIAGNÓSTICO PREIMPLANTACIONAL
   -1.2 DETERMINACIÓN DEL
   GENOTIPO

Answer 3

Utilidad a la hora de seleccionar embriones portadores de genes de interés a nivel de producción de carne o de leche

Microsatélites: aquellos genes asociados a determinados caracteres productivos. Son moléculas de ADN ordenadas sobre un sustrato sólido.

Question 4

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.1 ¿ Por qué se usa?

Answer 4

No interviene el macho ni la hembra

Se una x las limitaciones de la producción in vivo:
1. Embriones transferibles x
recogida : como max imposib
de subir 6/superovulación
(baja rentabilidad)

2. Algunas hembras no
   responden a los ttos y es
   necesario respetar un
   periodo de descanso

3.Baja frecuencia y necesidad de un tracto genital perfecto de las donantes

Question 5

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.2 Aplicaciones

Answer 5

1. Aumentar el rendimiento de los programas de producción de embriones
   - Permite utilizar hembras en
   situaciones fisiológicas
   diversas
   - Evita la necesidad de
   emplear gonadotropinas
2. Se obtiene un número mayor de embriones y con menor coste
3. • Recuperar la genética de las hembras de sacrificio obligatorio

4.Aumenta el aprovechamiento reproductivo de los animales infértiles

5. Hembras prepúberes tb son candidatas a ser donantes de ovocitos (incluso de ovarios fetales)
6. Animales infértiles por alteraciones uterinas y oviductales son útiles para la producción de ovocitos
7. Producción de embriones a partir de folículos primordiales

Question 6

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.3 Uso comercial

Answer 6

1. Bajo rendimiento (30-40%)
2. Embriones de - calidad, y con -
   potencial de desarrollo (30-
   40%)
3. +incidencia de mortalidad
   embrionaria, abortos y
   patologías gestacionales
   (hidroalantoides) q in
   vivo
4. La incidencia de distocias por exceso de volumen fetal también es mayor
5. Nacimiento de fetos muy voluminosos, con anomalías y
   menor vigor
6. Gestaciones más prolongadas

Question 7

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.4 ¿ Cómo se hace?

Answer 7

1. Obtención de ovocitos
2. Selección
3. Maduración in vitro hasta
   metafase I (fecundables)
4. Fecundación in vitro
5. Cultivo hasta estadíos
   transferibles a vacas en
   día 7 - 7.5 de ciclo (mórula o
   blastocistos)

Question 8

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.4 ¿ Cómo se hace?
   2.4.1 Obtención de ovocitos (sacrificados y vivos)

Answer 8

Técnicas para animales sacrificados
1. Se meten ovarios en solución salina calentada a una Tª similar a la corporal para llevarlos a lab

2. Se extrae el contenido de todos los folículos siguiendo la técnica deseada
   
   • Disección folicular
   • Punción folicular
   • Fileteado del ovario
   • Slicing
   • Digestión enzimática
3. Lo + Frec: punción folicular o
   el slicing -> cortes con
   el bisturí sobre toda la
   superficie + lavado
   después para extraer todos l
   os ovocitos

Técnicas para animales vivos
Reducido nº de veces q se extraen x requerir
técnicas quirúrgicas:
- Laparotomía (ovariectomía)
- Laparoscopía
- Aspiración transvaginal
ecoguiada (OPU) -> en
ovarios grandes NO
prepúberes

Question 9

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.4 ¿ Cómo se hace?
   2.4.2 Selección

Answer 9

Se seleccionan los ovocitos en función de:

1. CÉLULAS DEL CÚMULO
   (también conocido como
   complejo cúmulo-ovocito)
   - Necesaria una buena
   capa de cel del cúmulo
   para saber q está
   maduro
   - Los ovocitos envejecidos
   tienen las células
   dispersas y centros con
   pignosis
2. ASPECTO DEL CITOPLASMA: granular y heterogéneo
3. DIÁMETRO DEL OVOCITO (> 110 micrómetros) -> +diámetro mejor ovocito

Factores de condicionan la calidad:
- Fase del ciclo estral de la hembra
- Ausencia de un FD
- Diámetro de los folículos
- A mayor diámetro mayor
competencia
- Edad de la hembra
- PREPUBER BEST
- Adulta
- Edad Avanzada

Question 10

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.4 ¿ Cómo se hace?
   2.4.3 Maduración

Answer 10

1. Ovocitos en estufa en un medio de cultivo en forma de microgotas -> gotas metidas bajo aceite de parafina para:
   
   • Mantener el volumen
     pequeño
   • Concentrar los factores
     paracrinos
   • Mantener estables las
     variables de temperatura,
     humedad y atmósfera
     gaseosa ( CO2 tiene
     efecto tampón (f(x) ->
     mantener el pH estable))
2. El medios de cultivo + usado es el medio de cultivo celular (TCM) combi con sust q promueven maduración
3. Cambios en el ovocito que SUGIEREN MADURACIÓn:
   
   • Expansión del cúmulo
   • Aumento del espacio
     previtelino
   • Expulsión del 1º corpúsculo
     polar (fin meiosis I)
4. Las células del cúmulo secretan enzimas proteolíticas que aumentan la laxitud entre las uniones celulares

Question 11

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.4 ¿ Cómo se hace?
   2.4.4 Fecundación

Answer 11

Lo + habitual es usar semen congelado -> Problem
- Contiene como diluyentes
algunos elementos
que dificultan el proceso de
FIV si se introducen
en la gota de fecundación
- Gran parte de los
espermatozoides destruidos
en congelación y liberan
enzimas proteolíticas
de degradación si intros al
ovocito
Preparación del semen
1. Descongelar
2. Separación de los espermatozoides
- Tecnica Swim up
- Gradiente discontinuo de
percoll
* Se separan del liq seminal y
se agrupan en función de
su movilidad y morfología
3. La concentración introducida debe ser de 1000 espermatozoides/ovocito

4. En un = medio de cultivo (cocultivo) introducen los ovocitos maduros y los espermatozoides con
   motilidad ( 6-20 h y = condiciones q maduración)
5. Se añaden distintas sustancias para favorecer la capacitación y motilidad de los esp
6. ¿Espermat escasos? : Inyección intracitoplásmica de espermatozoides (en eq siempre se usa)
7. Ovocito sufre una serie de cambios estructurales (Células del cúmulo desaparecen): INDICADORES DE FECUNDACIÖN
   1. Presencia el 2º Corpúsculo
      polar al completarse la
      METAFASE II
   2. ID de espermat accesorios
      alrededor de la corona
      pelúcida
   3. ID de 2 pronúcleos 1masc y
      1fem
   4. ID de segmentación

Question 12

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.4 ¿ Cómo se hace?
   2.4.5 Cultivo

Answer 12

Es una fase de evolución del cigoto hasta alcanzar los estadios transferibles
1ºSe convierten en mórulas
2º Sufren el proceso de
compactación
3º Se forma el blastocele y la
masa celular interna
4º Eclosiona la zona pelúcida

Medios de cultivo
- Simples
- Complejos: suplementados con macromoléculas, células somáticas, quelantes o citoquinas

Question 13

2. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO
   2.5 Evaluación de calidad

Answer 13

1. Obtenido el embrión
   evaluamos:
   - Estadío de desarrollo adec
   - Esfericidad
   - Homogeneidad
   - Nº cel
   - Densidad de cel
2. Métodos de evaluación Invasivos:
   - Se basan en teñir los núcleos y
   contar el nº de cels que tiene el
   blastocisto
   - A mayor número de células,
   mayor calidad; en el proceso
   de evaluación el embrión
   muere pero nos permite
   estimar la calidad media

TABLA

In vivo
- Tª cte
- Oscuridad total
- Presiones de O2 y CO2 controladas
- Peq vol de secreciones genit rodeando embrio
- Medio dinámico con continuos cambios de compo

In vitro
- Tª no cte
- Luz diurna y microscopio
- Presiones de O2 y CO2
fluctuantes
- Gran vol de secreciones genit
rodeando embrio
- Medio dinámico con excesos o defecto

Question 14

3. CLONACIÓN (Que es y aplicacioens?

Answer 14

Proceso de obtención de varias copias de un mismo individuo, idénticas desde el punto de vista genético

APPS
1. Permite evaluar capacidades de adaptación del fenotipo dependiente del ambiente

2. Mantenimiento de la biodiversidad al ser una herramienta de construcción de criobancos de células somáticas obtenidas de razas en peligro de extinción
   - El problema es que este
   tipo de animales necesitan
   controles estrictos,
   inducciones de parto y
   control a posteriori
3. En investigación y como productos comerciales
4. Pueden clonarse animales aplicando edición génica, es decir, modificando su genoma.

Question 15

3. CLONACIÓN
   3.1 Métodos de clonación : Bisección embrionaria

Answer 15

1. Con una cuchilla microscópica de vidrio, se separa en dos un estadio de mórula
2. 1 d las partes se introduce en una zona pelúcida vacía y se transfiere cada embrión a una
   receptora
3. +nº de cortes -> probab hay de que ese individuo salga adelante

Question 16

3. CLONACIÓN
   3.1 Métodos de clonación : Métodos de transferencia celular

Answer 16

1. Transferencia del núcleo de una célula procedente del animal donante al citoplasma de un ovocito receptor
2. Los ovocitos receptores son sometidos a un proceso de enucleación para retirar su material genético.
3. Las células donantes pueden ser de origen embrionario o células adultas ( si usamos adultas dejar q surja el proceso inverso de diferenciación)
4. Introducir el ADN donante en el ovocito receptor enucleado
5. Transferir corriente eléctrica o emplear procedimientos químicos, para activar el proceso de fusión
6. Luego la célula empieza a dividirse como si fuera un embrión recién obtenido

Question 17

3. CLONACIÓN
   3.2 LIMITACIONES DE LA TÉCNICA

Answer 17

1. Baja efectividad
2. Elevado coste
3. Anomalías durante el
   desarrollo que provocan:
   
   • Mortalidad embrionaria/fetal
   • Síndrome de exceso de
     volumen fetal
   • Trastornos fisiológicos
     diversos: hidroalantoides,
     extrem y artic anormales,
     displasia cerebelar…
     4.No se controlan los efectos epigenéticos: un mismo gen puede expresarse de diferentes formas en función del ambiente
4. Envejecimiento prematuro porque los telómeros de un clon tienen la edad biológica del animal de procedencia
5. Aumenta la pérdida de diversidad genética

Question 18

4. ANIMALES TRANSGÉNICOS
   ¿Qué es y pq se utiliza?

Answer 18

Aquel cuyo genoma ha sido modificado de forma intencionada, mediante la incorporación de ADN procedente de otra especie

Se emplea con fines productivos porque
- Aumenta la resistencia a
enfermedades
- Aum la capacidad reproductiva
- Hay un mayor
aprovechamiento de
nutrientes
- Se modifica la masa muscular y
la producción de leche
- También se pueden modificar
genes reguladores del
crecimiento o de la secreción
de GH
- Para intentar que los animales produzcan prot humanas q son más caras sintéticas (alfa antitripsina paar enf resp raras)

Question 19

4. ANIMALES TRANSGÉNICOS
   4.1 TÉCNICA DE PRODUCCION

Answer 19

1. INYECCIÓN DEL GEN en el pronúcleo de un ovocito recién fecundado: realizarse antes de que ambos pronúcleos se fusionen o difícil es integrar en el material genético el gen y que cumpla con la función buscada
2. RETROVIRUS: vectores para introducir fragmentos de su ARN y los genes buscados en el núcleo. El genoma vírico debe integrarse en las células germinales
3. La inserción de fragmentos de ADN en CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS: en cultivo o incorporándolas a un blastocisto, luego es suerte que el ADN se integre en MCI y llegue a cel germinales (el obj es q tmtan esos genes)

** a veces usan un gen asoc a prot fluorescente para ver si lo expresan

*** repro en ellos es complicada xq puede haber la segregación de los genes