VO's week 4 Flashcards
(32 cards)
Wat is RNA-polymerase II?
RNA polymerase II is het enzym dat de transcriptie van eiwit-coderende genen uitvoert. Het is afhankelijk van hulp-eiwitten, transcriptie-factoren.
Hoe werken algemene transcriptiefactoren van het RNA polymerase II?
Ze binden eerst aan de promoter, waarna het RNA polymerase II bindt.
Op welke plek in het DNA kunnen we de promotor van een gen vinden?
Direct voor het punt waar de transcriptie van het gen begint. Promotor heeft een vaste positie, upstream van de transcriptie. Hieraan binden algemene transcriptiefactoren.
Waaruit bestaat een enhancer element?
een basevolgorde in het DNA, aan de enhancer binden specifieke factoren. Bepalen de hoeveelheid van expressie, waar en wanneer
Op welke plek in het DNA kunnen we de enhancer van een gen vinden?
Kan voor of achter de promotor zijn, het is altijd op hetzelfde chromosoom. De plek van de enhancer kan variëren. Ze loopen naar de promotor als ze ver weg zijn, als de enhancer dichtbij zit is het niet nodig.
Ergens in een gen is een mutatie opgetreden waardoor het mRNA langer dan normaal is geworden maar het eiwit korter dan normaal.
Welke mutatie kan in aanmerking komen (langer mRNA, maar toch een korter eiwit)?
Splice donor mutatie, bij een donor mutatie komt er een intron bij in het mRNA
Welke splice mutaties zijn er?
Mutatie van een spliceplaats, waardoor deze niet meer kan functioneren en resulteert in verlies van een exon (fout in acceptor site) of het niet uitknippen van een intron (fout in donor site).
Uit tumorcellen wordt genomisch DNA geïsoleerd en met behulp van de PCR methode geanalyseerd.
Vier specifieke primers zijn:
(1) een voorwaartse primer van exon 1
(2) een terugwaartse primer van intron 1
(3) een terugwaartse primer van exon 2
(4) een voorwaartse primer van exon 2
Welke combinatie van 2 primers kan gebruikt worden voor deze analyse?
1 en 2, 1 en 3, 3 en 4.
Welke moleculaire genetische technieken zijn er?
- Analyse van DNA: FISH, PCR, sequencing
- Analyse van RNA: RNA blot, RT-PCR (kopie van mRNA, naar DNA, met behulp van reverse transcriptase, hiervan kun je een PCR doen)
- Analyse van eiwitten: Westernblot, immunokleuring
Wat zijn de kenmerken van PCR?
Het is extreem gevoelig en je hebt zeer kleine hoeveelheden DNA nodig.
Waarvoor gebruiken we PCR?
- Opsporen van translocaties
- Meten van mismatch repair (MMR) activiteit
Wat is westernblotting?
eiwit analyse met specifieke antilichamen
Welke informatie kun je verkrijgen met westernblotting?
- Grootte van het eiwit (plaats van de band)
- Hoeveelheid van het eiwit (dikte van de band): hoe dikker de band hoe meer eiwit.
- Modificaties (bv fusie eiwitten door chromosomale translocaties): bv een extra band die je niet had verwacht.
Wat is een immunoblot?
Een immunoblot is een biochemische techniek waarmee een specifiek eiwit in een mengsel van eiwitten door middel van antilichamen gedetecteerd kan worden. In het algemeen worden de eiwitten in het eiwitmengsel eerst gescheiden op basis van hun grootte of beter gezegd, moleculair gewicht door middel van een gelelektroforese. Vervolgens worden de eiwitten die gescheiden zijn op grootte van de gel “overgebracht” naar een nitrocellulose- of PVDF-membraan waar ze vervolgens aan hechten. Dit proces wordt blotten genoemd.
Twee verschillende probes voor het BCR-gen: De voorkant van het BCR-gen (5’-bcr) en de achterkant van het BCR-gen (3’-bcr) gebruikt.
cABL verhuist van chr. 9 naar chr. 22. Hoe staat het met het BCR-gen?
5’ BCR blijft op chr. 22 en 3’ BCR gaat naar chr.9. Het enige stuk BCR dat bij ABL is, is het begin van BCR. Die kleur je dus aan met 5’BCR. Het Philadelphia chromosoom bestaat uit de promotor en een paar exonen uit BCR en exonen en intronen uit ABL.
Van wat voor soort translocatie is er sprake bij CML?
Bij CML is er sprake van een gebalanceerde translocatie.
Hoe zou het 8.5kb mRNA bij de patiënt verklaard kunnen worden?
fusie mRNA BCR-ABL
Hoe werkt RT-PCR met BCR-ABL als voorbeeld?
De analyse verloopt in meerdere stappen. Eerst wordt mRNA geïsoleerd uit een beenmergmonster van de patiënt. Daarvan wordt dan met behulp van poly T primer en het enzym reverse transcriptase cDNA gemaakt. Vervolgens wordt dit cDNA mengsel onderworpen aan een PCR met behulp van primers specifiek voor coderende gebieden uit BCR en ABL. Tenslotte worden de verkregen DNA fragmenten door gel-elektroforese gescheiden en het DNA wordt zichtbaar gemaakt. De methode als geheel wordt RT-PCR (reverse-transcribed PCR) genoemd.
Er werd een mengsel gebruikt van drie specifieke primers:
(1) een voorwaartse primer van een 5’ coderend gebied van BCR
(2) een terugwaartse primer van een 3’ coderend gebied van BCR
(3) een terugwaartse primer van een coderend gebied in ABL
Welke combinatie van primers zijn verantwoordelijk voor PCR- product 1 en welke voor product 2?
product 1: 1 en 2, product 2: 1 en 3
Bij patiënt 1, 2 en 6 heeft PCR-product 2 dezelfde lengte. Hoe kan dat? Wat zou er aan de hand zijn bij patiënt 5?
Omdat de DNA breuk in hetzelfde intron heeft plaatsgevonden. Het DNA breekt vaak op hetzelfde punt omdat het daar gevoeliger is voor dubbelstrengsbreuken. Patiënt 5 kan een extra exon bevatten.
Wat is het gevolg van een t(14;18) bij een folliculair B-cel lymfoom?
Het gevolg van de translocatie is dat het BCL2-gen (gelegen op chromosoom 18q) nu in de nabijheid komt te liggen van de enhancer van het IgH gen op 14q32, dat codeert voor de zware ketens (heavy chain) van de immuunglobulinen. De expressie van het BCL2-gen komt dan onder controle van de IgH enhancer. De IgH-enhancer stimuleert de transcriptie van het IgH-gen: in de B-lymfocyten is dit gen uiteraard zeer actief. Zo wordt ook de transcriptie van het BCL2-gen sterk gestimuleerd. Deze t(14;18) translocatie komt bij >90% van de folliculaire B-cel lymfomen voor. Hiervoor geldt situatie B, zie plaatje eronder.
Welke blot past bij deze patiënt (met folliculair B-cellymfoom)?
Blot C, omdat het niet twee genen zijn die bij elkaar komen. Het is 1 gen waarvan het expressieniveau is veranderd.
Wat is er kenmerkend aan het lymfoom van Burkitt?
Bij het lymfoom van Burkitt heeft een translocatie plaatsgevonden tussen de chromosomen 8 en 14. Het gevolg van de translocatie is dat in dit geval het c-myc gen (gelegen op chromosoom 8q) nu in de onmiddellijke nabijheid komt te liggen van de enhancer van het IgH-gen. Zo wordt de transcriptie van het c-myc gen sterk gestimuleerd.
Waarom zijn deze lymfomen klinisch zo verschillend?
c-myc en Bcl2 hebben verschillende functies. c-myc = een gen die celdeling promoot. Het BCL2-gen is betrokken bij de regulatie van de apoptose. BCL2 en BAX regelen samen (in onderling evenwicht) de apoptose. Meer BCL2 onderdrukt en meer BAX stimuleert: dus overexpressie van BCL2 bemoeilijkt apoptose. Het lymfoom van Burkitt komt meestal voor bij jonge mensen en is een zeer agressieve (snel groeiende) tumor. Het folliculair B-cel lymfoom (waar Bcl2 bij betrokken is) komt juist zelden voor bij jonge mensen maar meestal bij ouderen (gemiddeld boven de 60 jaar) en is een zeer langzaam groeiend lymfoom.
