Semaine 6_MS, Chromato, IDMS

Question 1

Nommer et décrire deux modes d’ionisation fréquemment adoptés en GC/MS.

Answer 1

1. Ionisation d’électron (EI) : La plus couramment utilisée en GC/MS. Les molécules, déjà en phase gazeuse, sont bombardées d’un faisceau d’électrons. Le faisceau d’électrons est produit en accélérant des électrons à travers un champ électrique, produisant un faisceau à haute énergie. Les électrons se rapprochent étroitement des molécules d’analyte neutres non chargées, provoquant l’éjection d’un électron des molécules d’analyte et la formation de cations radicaux. Ce processus génère des fragments caractéristiques de la molécule, ce qui permet d’identifier les composés présents dans l’échantillon.
2. Ionisation chimique (CI) : méthode d’ionisation moins courante, mais qui peut être utilisée dans certains cas. Elle implique l’utilisation d’un réactif chimique, tel qu’un gaz réactif (comme le méthane), qui réagit avec les molécules d’échantillon pour former des ions protonés. Contrairement à l’EI, l’ionisation chimique produit principalement des ions moléculaires [M]+, qui sont moins fragmentés que les ions obtenus par EI. Cela peut être utile pour l’identification de composés organiques de grande taille ou de composés peu volatils qui pourraient se dégrader lors de l’ionisation par EI.

Question 2

Nommer et décrire trois modes d’ionisation fréquemment adoptés en LC/MS

Answer 2

1. Ionisation par électrospray (ESI): Méthode d’ionisation couramment utilisée. Elle repose sur le principe de l’électrospray, où l’échantillon est introduit dans une source d’ionisation par un flux liquide et est ensuite pulvérisé sous forme de fines gouttelettes. Ces gouttelettes sont chargées électriquement par un potentiel élevé appliqué à la source d’ionisation, ce qui génère des ions dans la phase gazeuse. L’ISE est particulièrement adaptée pour l’analyse de composés polaires et ioniques.
2. Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI): Une solution contenant un analyte est transformée en une fine pulvérisation à l’aide d’un nébuliseur pneumatique. Le spray est ensuite dirigé vers une zone chauffée (450 °C à 550 °C), où les gouttelettes de solvant sont évaporées. L’échantillon désolvaté et vaporisé est ensuite amené dans une seconde chambre vers une aiguille électrode chargée positivement ou négativement. Lorsque les molécules vaporisées passent près de l’aiguille électrode, elles sont ionisées par réactions chimiques avec les ions présents par une décharge électrique. L’APCI est souvent utilisée pour l’analyse de composés moins polaires et apolaires.
3. Photo-ionisation à pression atmosphérique (APPI): L’échantillon est nébulisé et vaporisé à pression atmosphérique, puis exposé à une source de lumière ultraviolette (UV). Les photons UV produits par la lampe excitent les molécules de l’échantillon, qui réagissent ensuite avec des réactifs chimiques présents dans la source d’ionisation pour former des ions (toluène). L’APPI est souvent utilisée pour l’analyse de composés non polaires et peu volatils.

Question 3

Décrire l’ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI)

Answer 3

Fonctionne en préparant l’échantillon d’intérêt avec une matrice, qui est généralement un composé organique solide. L’échantillon et la matrice sont mélangés, puis déposés sur une plaque ou une cible spéciale. Le mélange séché forme des cristaux dans lesquels l’échantillon est piégé.

Ensuite, une impulsion laser de haute énergie est dirigée sur la plaque ou la cible, ce qui provoque l’évaporation rapide de la matrice et de l’échantillon. Sous l’effet de cette vaporisation, les molécules de l’échantillon sont arrachées de la surface de la matrice et ionisées.

Les ions formés dans le MALDI sont ensuite accélérés dans un champ électrique vers un analyseur de spectrométrie de masse, généralement un spectromètre de masse de type TOF (Time-of-Flight).

Question 4

Que veut dire MRM et décrit son fonctionnement

Answer 4

MRM = Multiple reaction monitoring. Mode fréquemment utilisé en clinique.

Brièvement, dans le mode MRM:
1. Les ions précurseurs arrivent dans le premier quadripôle sous-vide où ils sont sélectionnés par leur masse/charge.
2. Les ions ayant la bonne masse/charge sont ensuite dirigés dans la chambre de collision (avec bombardement à l’azote) où ils subissent une fragmentation multiple avec une empreinte spectrale unique.
3. Les fragments sont ensuite envoyés dans le 2e quadripole sous vide où un ou plusieurs fragments sont sélectionnés par leur masse/charge.
4. Seulement les molécules sélectionnées seront détectées. Ce mode d’analyse permet une grande spécificité puisque seulement la bonne combinaison de molécules mère-fille est détectée.

Question 5

Nommer des avantages et inconvénients du MS par rapport aux immunoessais

Answer 5

Avantages = Sensibilité et spécificité plus élevé, faible limite de détections (mesure de petite qté) par rapport à l’immuno qui est plus élevé.

Inconvénients = Méthode plus longue que immuno (qui est moins d’une heure). Requiert une expertise technique plus grande.

En contexte de dépistage de drogue, le test d’immunoessais identifie seulement les classes alors que le MS identifie des drogues spécifiques ainsi que leurs métabolites. Toutefois, avec le LC-MS/MS, des molécules précises sont recherché, celles-ci doivent donc être incluses dans les librairies de référence afin d’être identifié.

Question 6

Quels sont les caractéristiques d’un standard interne idéal (N=3)?

Answer 6

1. Doit se comporter le plus possible comme l’analyte mesuré (temps de rétention, l’effet d’ionisation et la réponse du MS)
2. Être stable
3. Être séparable/distinguable de l’analyte dosé

Les meilleurs standards sont généralement des versions deutérées (stable-labeled) en MS. Pour les autres détecteurs, l’utilisation de la molécule deutérée est impossible, car elle ne serait pas distinguable de l’analyste d’intérêt.

Question 7

Définit le rôle du standard interne

Answer 7

Composé ajouté à une concentration fixe dans l’échantillon à analyser afin de compenser la variation des conditions analytiques tel que la préparation de l’échantillon, le volume d’injection, l’appareil utilisé et l’effet matrice. En faisant le ratio entre l’analyte dosé et le SI, la concentration de l’analytes est reflété indépendamment des conditions analytiques énumérées plus haut.

Question 8

Quoi faire s’il n’existe pas de version deutérée du standard interne en MS?

Answer 8

Faire ajout d’un mélange de trois standards internes différents qui présentent des masses, des temps de rétention et des structures différents. Par la suite, le SI avec la meilleure réponse est choisi pour effectuer les ratios.

Question 9

Qu’est-ce que l’IRMS (spectrométrie de masse à rapport isotopique) et donner un exemple d’utilisation.

Answer 9

Isotope Ratio Mass Spectrometry. Détection d’isotope radioactif avec le MS (Permet la mesure relative de l’abondance des isotopes).

Par exemple, les isotopes stables sont utilisés pour le diagnostic des ulcères causés par H. pylori.

Dans cette application, un patient ingère un échantillon d’urée enrichie en 13C ; celui-ci est métabolisé par H. pylori (si présent) pour produire du 13CO2 enrichi dans l’haleine. Le CO2 est enrichi en 13C (m/z 45) par rapport à l’abondance naturelle du même pic isotopique (m/z 44). L’haleine est analysée avec un spectromètre de masse, et le rapport des intensités maximales de m/z 45 et m/z 44 est mesuré avec précision. Un rapport élevé peut indiquer une infection à H. pylori.

Question 10

Qu’est-ce que l’IDMS et donner un exemple d’utilisation.

Answer 10

Isotope dilution-mass spectrometry: méthode analytique utilisée pour la quantification précise des composés chimiques dans un échantillon. Elle est basée sur le principe de la dilution isotopique, combinée à la spectrométrie de masse.

Par exemple, au CHUM, l’IDMS est utilisée pour assigner les valeurs cibles de créatinine dans les échantillons du programme d’assurance qualité externe pour la mesure de la créatinine sérique (établir une valeur de matériel de référence).

Question 11

En IDMS, pourquoi préférer l’utilisation de standard interne 3x deutérée au lieu d’une fois ?

Answer 11

Le pic analytique et le pic du standard interne ne doivent pas se contaminer 3x deutérée espace donc de façon plus marqué les pics qu’un seul deutérée.

Question 12

Décrivez brièvement les avantages d’un spectromètre de masse comme détecteur d’un chromatographe gaz-liquide par opposition à un détecteur plus conventionnel. (OCQ anal 2001 A6)

Answer 12

Le MS offrir une meilleure sélectivité/spécificité sensibilité et une meilleure polyvalence par rapport à un détecteur plus conventionnel. Cela permet une meilleure identification et quantification des composants individuels dans un échantillon, ainsi qu’une détection plus précise des composants à faible concentration dans un échantillon complexe.

Les détecteurs conventionnels en GC tel que le NDP et l’ECD ont une meilleure sensibilité analytique. Le FID à une meilleure linéarité.

Pour ce qui est des détecteurs conventionnels en LC, le MS a une sensibilité analytique comparable à la fluorescence et plus faible que l’electrochimie.

Question 13

Décrire les principes de base de chacune des techniques suivantes : chromatographie d’échangeur d’ions, chromatographie d’affinité, chromatographie en phase gazeuse. (OCQ anal 1996 C2)

Answer 13

Chromatographie d’échangeur d’ions : Technique de séparation basée sur les charges électriques des molécules, utilisant des résines chargées pour retenir et échanger les ions.

Chromatographie d’affinité : Technique de séparation basée sur des interactions spécifiques entre une molécule cible et une molécule de liaison immobilisée sur une matrice de support.

Chromatographie en phase gazeuse : Technique de séparation utilisant un gaz vecteur pour déplacer les composants d’un échantillon à travers une colonne remplie de matériau stationnaire, basée sur la volatilité et les interactions avec la matrice stationnaire.

Question 14

Qu’est-ce qu’un plateau théorique en GC ou HPLC ?

Answer 14

Zone hypothétique dans une colonne chromatographique où un équilibre existe entre les phases mobile et stationnaire. C’est une mesure de l’efficacité de la colonne ou de sa capacité à séparer les différents composants d’un échantillon. Une colonne avec plus de plateaux théoriques offrira une meilleure résolution des composants de l’échantillon.

Question 15

Explique le principe d’un détecteur FID en chromatographie

Answer 15

Flame ionization detector. Utilisé en GC pour détecter les composés organiques. Lorsqu’ils entrent en contact avec la flamme d’hydrogène-air, ils produisent des ions et des électrons. Ces ions et électrons sont collectés par des électrodes et génèrent un courant électrique. Le courant mesuré est proportionnel à la concentration des composés organiques dans l’échantillon.

Question 16

Quel est la différence entre une HPLC normal est une HPLC en phase inverse ?

Answer 16

En chromatographie en phase normale, la phase stationnaire est polaire (silice) et la phase mobile est non polaire (hexane). En phase inverse, la phase stationnaire est hydrophobe (non polaire, C18/C8/C4) et la phase mobile est polaire (méthanol, acétonitrile).

Ce renversement des polarités des phases permet une meilleure rétention des composés hydrophobes sur la colonne, car ils ont une affinité plus forte pour la phase stationnaire hydrophobe. Ainsi, les composés hydrophiles se déplacent plus rapidement à travers la colonne, tandis que les composés hydrophobes sont retenus plus longtemps, ce qui permet leur séparation efficace.

Question 17

Schématise un LC-MSMS et ses composantes.

Answer 17

Question 18

À quoi fait référence la résolution ? Quel est sa formule?

Answer 18

Capacité à séparer convenablement deux substances : 𝑅𝑠=2(𝑡𝐵−𝑡𝐴)/(𝑊𝐴+𝑊𝐵), Min = 0.8, Idéal > 2

Question 19

Formule du plateau théorique

Answer 19

=16(Tr/W)^2 ou 5.545(Tr/W1/2)^2

Question 20

Describe the physicochemical processes that allow for separation of molecules by ion-exchange.

Answer 20

Solutes are separated based upon their relative net charge in the mobile phase

The affinity of a given solute for the stationary phase can be altered by adjusting the pH and/or ionic strength of the mobile phase

Cation or anion exchange chromatography
- Example image is cation exchange
- Separated by how charged, how big molecule is relative to charge that it has

Question 21

Describe the physicochemical processes that allow for separation of molecules by steric exclusion (gel filtration).

Answer 21

Size exclusion chromatography

Stationary phase has pores in them, solutes small enough to fit into pores will randomly diffuse into and out of pores before they move on
- Too large solutes just pass around the stationary phase
- Smaller molecule, longer time to leave the column

Question 22

Describe the physicochemical processes that allow for separation of molecules by adsorption (thin layer chromato)

Answer 22

Differential adsorption
- separation due a series of absorption/deabsorption steps with the stationary phase
- staionary gel is a silica gel
- molecules in mobile phase which will equilibrate between two phases, that interaction is absorption in which an van der waals interaction between molecule and stationary phase
- favored adsorption between mobile vs stationary phase

Question 23

What is the mobile phase? Stationary phase?

Answer 23

The stationary phase may be a thin coating of material on a flat, open surface (planar) or it may be packed into or lining the inner wall of a closed tube (column)
- The stationary phase may be a solid, or a liquid that is immobilized onto an inert solid
- this what the sample interacts with to determine the elution time

The mobile phase may be a liquid, or a gas and contains the sample

Question 24

Formule d’Hauteur d’un plateau théorique (H)

Answer 24

H=Longueur colonne/plateau théorique

Question 25

Défini le facteur de rétention et son équation

Answer 25

Temps qu’une substance passe dans la phase stationnaire par rapport à la phase mobile. 𝒌= (𝒕𝑹−𝒕𝟎)/𝒕𝟎 = (𝒕𝑹/𝒕𝟎) – 𝟏

Question 26

À quoi fait référence la sélectivité ?

Answer 26

Différence d’affinité de deux substances pour la phase stationnaire 𝜶 = 𝒌𝑩/𝒌𝑨 =(𝒕𝑩−𝒕𝟎)/𝒕𝟎 / (𝒕𝑨−𝒕𝟎)/𝒕𝟎

Question 27

Diagram a HPLC system and name the essential components.

Answer 27

In column chromatography, the mobile phase is pumped, at a constant flow rate, through the column that holds the stationary phase

The sample is injected into the mobile phase (boucle d’injection), in a narrow band, as the mobile phase enters the column

The different solutes in the sample establish their equilibrium distribution between the mobile phase and the stationary phase

Solutes whose equilibrium distribution favors the mobile phase will elute from the column more rapidly than solutes whose equilibrium favors the stationary phase

Question 28

Diagram a GC system and name the essential components.

Answer 28

• column w/ stationary phase that are 3m to 30m long (much longer), wound columns instead of straight, separation accomplished by gas-liquid interaction,

-Analytes need to be converted to vapor phase in order to be analyzed, column kept at high temperature (150-250C) - usually in an oven - keep in vapor phase
- requires gas mobile phase (hélium, hydrogène, azote)
- use ret time to qualitatively identify what peaks are as the come through the column
- requires EXTREMELY stable flow rate (up to 3 checks)

Question 29

Qu’est-ce que la dérivation chimique, son but et ses caractéristiques essentielles

Answer 29

Réactions qui permet la Conversion des groupes polaires, NH, OH, SH, en non polaire et/ou d’Éliminer les ponts H entre analyte et phase stationnaire solide. Tel que
* Silylation (+ fréquente, préliminaire à la chromatographie)
* Alkylation (colonne)
* Acylation et estérification (lipides)

But :
Rendre la molécule thermostable ou volatile, Améliorer la chromatographie

Caractéristiques :

• Doit mener à une réaction complète et reproductible avec l’analyte
• Réactif éliminable et non-interférant
• Pas endommageable pour la colonne
• Dérivé stable doit être formé

Question 30

Nommez 4 types de détecteurs utilisés en GC, leurs caractéristiques et principes

Answer 30

1) Détecteur à ionisation de flamme (FID): Composé brûlé dans une flamme Air/H2 libère des électrons et mesure du courant généré.
Détection : masse
Détecteur universel (nbr Carbones)
Linéarité : très ~7 ordres de grandeur
Sensibilité : ~10-100pg

2) Nitrogen-Phosphorus Detector (NPD): Composé brûlé dans une flamme Air/H2 + bille de rubidium ou césium libère des électrons et mesure le courant généré.
Détection : masse
Détecteur sélectif (nbr PO4, N)
Linéarité : oui ~ 5 ordres de grandeur
Sensibilité : 0.1-10pg

3) Détecteur à capture d’électrons (ECD): Émission de particules β via une source radioactive (63Ni) Collision des particules avec gaz vecteur produit des électrons (courant électrique) Composés électronégatifs capture les électrons Mesure ↓ du courant
Détection : concentration
Détecteur sélectif (nbr de composés Électronégatif, Halogénés)
Linéarité : modéré ~ 3 ordres de grandeur
Sensibilité : 0.05-1pg

4) MS: Ionisation Sélection des masses Quantification des molécules de masse données.
Détection : masse Détecteur universel (Ionisé)
Linéarité : modéré ~ 3 ordres de grandeur
Sensibilité : 10pg à 1,000pg

Question 31

Qu’est-ce que l’équation de Van Deemter ?

Answer 31

The van Deemter equation relates height equivalent to a theoretical plate (HETP) of a chromatographic column to the various flow and kinetic parameters which cause peak broadening, as follows:

HETP = A + (B / u) + Cu

Where

HETP = a measure of the resolving power of the column [m]
A = Eddy-diffusion parameter, related to channeling through a non-ideal packing [m]
B = diffusion coefficient of the eluting particles in the longitudinal direction, resulting in dispersion [m2 s−1]
C = Resistance to mass transfer coefficient of the analyte between mobile and stationary phase [s]
u = speed [m s−1]

Question 32

What is eddy diffusion? How is it related to the Van Deemter equation

Answer 32

anytime a column packed w/ stationary phase particles, can take diff paths to get through the column, coming out at diff times, more of this means broader peaks (small particle sizes, capillary column instead of packed)

A on van deemter equation