Examen 1 Flashcards
(102 cards)
1
Q
Qu’est-ce qu’un clonage moléculaire?
A
Ensemble des étapes nécessaires à la production d’une molécule d’ADN recombinante
2
Q
De quoi est issu une molécule d’ADN recombinante?
A
- DE la ligation d’un fragment d’ADN exogène avec une molécule d’ADN réceptrice
3
Q
Quelle est la molécule d’ADN réceptrice?
A
Un vecteur de clonage
4
Q
Q’arrive-t-il suite à la création d’une molécule d’ADN chimère lors d’un clonage?
A
Elle est reproduite pour mener à l’apparition d’un grand nombre de copies (clones
5
Q
Quel est l’utilité d’un clonage moléculaire?
A
Permet d’analyser le rôle d’un fragment d’ADN, le fonctionnement d’un gène ou produire la protéine correspondante dans un organisme différent
6
Q
Que permet la réintroduction de la molécule recombinante dans une bactérie?
A
Permet la réplication de l’ADN et l’apparition de plusieurs copies identiques
7
Q
Quelles sont les différences entre la transcription eucaryote et procaryote?
A
- Épissage des introns
- Queue poly-a
- Coiffe 5’
8
Q
Quel type de molécule doit on utiliser pour le clonage moléculaire?
A
On utilise un ARNm pour produire un ADN complémentaire à utiliser pour le clonage
9
Q
Quel est le rôle des endonucléases?
A
Capables de reconnaître et couper une séquence spécifique à l’intérieur de la double hélice d’ADN
10
Q
Comment sont nommés les endonucléases?
A
Le nom du microorganisme où elle a été isolée la première fois
11
Q
Quelle est l’utilité des endonucléases dans le clonage?
A
Construction de molécules d’ADN recombinantes
12
Q
L’utilisation d’enzymes de restrictions est très utile pour quoi?
A
Pour détecter certaines mutations ou maladies
13
Q
Qu’est-ce qu’un sites de reconnaissance?
A
Séquences spécifiques allant de 4 à 16 nt
14
Q
Quelle est la particularité des séquences reconnues?
A
Séquences palindromes
15
Q
Quels sont les 3 types de molécules qui peuvent être produites par la digestion?
A
- Avec extrémité 3’ saillante
- Avec extrémité 5’ saillant
- À bouts francs
16
Q
Qu’est-ce que les ligases d’ADN?
A
ENzymes capables de reconstituer la liaison phosphodiester entre le 5’ P et le 3’ OH de deux nucléotides adjacents d’un brin d’ADN
17
Q
Quelle enzyme de restriction est exrêmement utilisée en recherche?
A
EcoRI
18
Q
Quelle séquence est reconnu par EcoRI?
A
GAATTC
19
Q
EcoRI coupe de quelle manière?
A
Laisse des bouts cohesifs
20
Q
Qu’est-ce qu’un plasmide?
A
Molécules ciruclaires d’ADN double brin, présentes à l’état naturel dans le cytoplasme bactérien
21
Q
Les plasmides sont quel type d’ADN pour les bactéries?
A
Extra-chromosomique
22
Q
Quelle est la caractéristique des plasmides?
A
Peuvent se répliquer de façon autonome
23
Q
Que comprennent les plasmides?
A
- Éléments nécessaires à leur réplication
- AUtre gènes qui confèrent des propriétés particulières à la cellule réceptrice
- Gène de résistance à un antibiotique ou métaux lourds
24
Q
Est-ce qu’un plasmide peut se transmettre aux cellules filles d’une bactérie?
A
oui
25
Qu'est-ce qu'un vecteur de clonage?
Molécule d'ADN qui a été construite pour accueillir des fragments d'ADN exogènes
26
Quel est le rôle des vecteurs de clonage?
Transporter des fragments d'ADN d'intérêt
27
Quel est habituellement l'origine des vecteurs de clonage?
Plasmide naturels qui ont été modifiés pour répondre aux besoins des expériences de biologie moléculaire
28
Quelles sont les 3 composantes de bases d'un vecteur de clonage?
- Origine de réplication
- Marqueur de sélection
- Site de clonage multiple
29
Quel est le rôle de l'origine de réplication?
Assure la réplication autonome du vecteur dans une cellule
30
Quel est le rôle du marqueyr de sélection?
Permet de savoir quelles cellules bactériennes ont incorporé une copie du vecteur
31
Quel est le type de marqueur de sélection le plus utilisé?
Les gènes de résistance aux antibiotiques
32
Quel gène de résistance est fréquemment utilisé?
- Le gène de la b-lactamase pour la résistance à l'ampicilline
33
Qu'est-ce qu'un site de clonage multiple?
- Séquence d'ADN qui a été ajoutée au vecteur
- Contient une multitude de sites reconnus par des enzymes de restriction
- FAcilitent l'introduction dirigée de fragments d'ADN exogènes dans le vecteur
34
Que faut-il pour introduire un insert dans un vecteur?
L'insert doit être digéré par des enzymes de restriction compatibles avec certains sites du SCM
35
Quelle est la particularité des sites de restriction présents dans le SCM?
Ils doivent être uniques dans le vecteur sinon il serait couper à plusieurs endroit
36
Qu'est-ce que le marqueur de criblage?
- Rôle complémentaire au marqueur de sélection
- Permet d'identifier les colonies qui possèdent la construction d'ADN plasmidique recherchée
37
Sur une gélose, que voit-on en cas de sélection?
Seules les cellules ayant reçu une molécule recombinante poussent
38
Sur gélose, que voit-on en cas de criblage?
Toutes les cellules poussent, mais elles peuvent êter différenciées selon une caractéristique (couleur par exemple)
39
Que permet la combinaison sélection-criblage?
Permet d'identifier les cellules ayant incorporé les vecteurs, mais aussi celles comportant un vecteur qui contient l'insert
40
Quel est le marqueur de criblage le plus utilisé?
Le gène LacZ de l'opéron lac
41
Les bactéries E. coli utilisent quelle molécule pur faire de l'énergie?
Sont capable d'utiliser le lactose mais préfèrent utiliser le glucose (plus facile)
42
Qu'arrive-t-il si seul le lactose est disponible dans le milieu?
Les bactéries expriment les gènes de l'opéron lac
43
Le gène lac contient combien de gènes?
3 gènes :
- LacZ
- LacY
- LacA
Transcrits en 1 seul ARNm
44
Quel gène code pour la b-galactosidase?
Lac Z
45
Que fait la b-galactosidase?
Hydrolyse le lactose en glucose et galactose
46
Quelles sont les 3 séquenc d'ADN régulatrices de l'opéron lac?
1. Promoteur
2. Opérateur
3. Site CAP
47
Qu'est-ce que le promoteur?
Site de liaison de l'ARN polymérase
48
Qu'est-ce que l'opérateur?
Site régulateur négatif lié par le répresseur lac
49
Qu'est-ce que le site CAP?
SIte régulateur positif lié par la protéine activatrice du catabolite
50
Quelles sont les 2 conditions dans lesquelles E. coli exprime l'opéron lac?
1. Le lactose est disponible
2. Le glucose n'est pas disponible
51
Comment et quand le répresseur Lac fonctionne?
En présence de glucose et absence de lactose, il réprime la transcription de l'opéron lac
Il se lie étroitement à l'opérateur, empêchant la transcription par l'ARN pol
52
Qu'arrive-t-il au répresseur en présence de lactose?
Il perd sa capacité à se lier à l'ADN à cause de l'allolactose
53
Qu'est-ce que l'allolactose et que cause-t-il?
- Isomère du lactose produit par la bactérie lorsque le lactose est disponible
- Induit un cahngement de conformation du répresseur Lac qui l'empeche de se lier à l'ADN
54
LE gèn lacZ est-il codé dans le génome et dans le plasmide des bactéries?
- Dans le génome bactérien
55
De quoi est composé la b-galactosidase?
deux domaines fonctionnels
- Peptide alpha
- Peptide oméga
56
Quelle est la particularité de la souche E. coli utilisée?
Elle exprime une b-galactosidase non fonctionnelle
La séquence du gène encodant le peptide alpha est muté ou non exprimé
57
QUe doit contenir le vecteur de clonage pour le criblage?
COmporte la séquence du gène lacZ qui encode le peptide alpha non muté
58
Où est inséré le gène lacZ dans le vecteur?
Juste après le SCM sans modifier le cadre de lecture du gène
59
Qu'arrive-t-il en l'absence d'un insert dans le SCM quant à l'apparence de la bactérie?
L'expression du peptide alpha est induit par l'IPTG (analogue de l'allolactose), la b-galactosidase dégrade le X-gal, qui produit un pigment bleu
Les colonies sont donc bleues
60
Qu'arrive-t-il en présence d'un insert quant aux colonies sur gélose?
L'insertion interrompt la traduction du peptide, les colonies sont donc blanches
61
Qu'est-ce qui cause l'arrêt de la traduction du peptide alpha lors de l'ajout de l'insert?
L'ajout de l'insert ajoute un codon stop avant le début de la traduction du peptide alpha
62
Que permet l'utilisation de la bactérie E. coli?
- Préparer de l'ADN plasmidique en petite ou en gande quantité
- Pour produire des protéines recombinantes
63
Pourquoi utiliser des souches d'E. coli?
- Simplicité
- Rapidité : temps de division très court (20min)
- Facilité des manipulation
64
Quelles souches d'E. coli sont utilisées en laboratoire?
Plusieurs souches qui ont été optimisées sur le plan génétique en vu des usages divers
65
Qu'est-ce qu'une transformation bactérienne par plasmide?
Action d'introduire de l'ADN plasmidique (vecteur) dans une bactérie
66
Quel est le but d'une transformation bactérienne?
Obtenir une grande quantité de l'ADN d'intéret
67
Quelles sont les deux méthodes principales de transformation bactérienne avec de l'ADN?
1. Transformation par la chaleur (chimique)
2. L'électroporation (physique)
68
Quelle est la condition particulière requise pour une transformation?
Il faut des bactéries compétentes : aptes à laisser entrer l'ADN plasmidique (induite ou achetée)
69
Comment isoler les bactéries ayant acquis un plasmide suite à une transformation?
Utilisation d'un milieu sélectif à l'ampicilinne
70
Quel type de souche d'E. coli il faut utiliser pour un clonage et pourquoi?
- Des souches qui ne peuvent pas méthyler l'ADN
- Car la méthylation sert à protéger le génome bactérien contre les coupures par ses propres enzymes de restriction
- Donc le plasmide ne pourra par être digéré
71
Quelles sont les autres mutations de souches d'E. coli possible?
- REcombinaison : éviter l'intégration des plasmides dans le génome bactérien
- Activation des endonucléases : éviter de dégrader les plasmides introduits
72
Sur une gélose, quelles colonies doivent être conservées?
Les colonies blanches
73
Quelle souche d'E.coli est utilisée et quelles sont ses caractéristiques?
- La souche DH5a
- Elle contient le gène du peptide oméga fonctionnel
- Le gène du peptide alpha est muté
74
Qu'est-ce que la complémentation alpha?
C'est le fait que le vecteur doit fournir le peptide alpha pour rendre la b-galactosidase fonctionnelle
75
Quelle est la méthode d'extraction de l'ADN plasmidique la plus utilisée?
LA mini-préparation par lyse alcaline (miniprep)
76
Quelles sont les 6 étapes du miniprep?
1. Mise en culture
2. Lyse bactérienne
3. Neutralisation
4. Purification
5. Lavage et élution
6. Dosage par spectrophotométrie
77
Dans quoi est fait la lyse bactérienne?
Dans un tampon alcalin en présence de SDS et de RNase
78
Quel est le rôle du SDS dans l'étape de lyse bactérienne?
SOlubilise les phospholipides et les protéines de la membrane cellulaire libérant ainsi le contenu de la bactérie
79
Comment est effectué l'étape de neutralisation lors de l'extraction?
PAr l'ajout d'une solution saline qui précipitera la plupart des composants cellulaires autre que le plasmide (membranes, protéines, ADN génomique)
80
Comment est purifié le plasmide lors de l'extraction?
Avec une colonne d'affinité
81
Quelle est la façon la plus courante de visualiser l'ADN sur gel d'agarose?
Colorer aec des produit fluorescents comme le bromure d'éthidium
82
Qu'est-ce que le bromure d'éthidium?
Colorant qui s'intercale entre les bases de la double hélice et devient fluorescent quand il est excité par rayons UV
83
Sous quelle forma apparait l'ADN lorsqu'on utilise le bromure d'éthidium?
Des bandes orangées plus ou moins intenses
84
Quelles sont les étapes d'un clonage moléculaire?
1. Élaboration d'une stratégie de clonage
2. Digestion et purification du vecteur et de l'insert digérés
3. Ligation de l'insert avec le vecteur
4. Transformation de la bactérie avec le produit de ligation
5. Sélection/criblage et identification des transformants contenant la construction recherchée
85
Qu'est-ce que l'insert?
Fragment d'ADN excisé d'un autre vecteur ou fragment amplifié par PCR à partir d'ADN génomique
86
Par quoi est guidé le choix du vecteur?
Les besoins d'une expérience
87
Qu'est-ce que le gène gfp?
Gène de 717pb qui code pour une séquence en acides aminés de 238aa -) protéine GFP
88
Quel est le facteur qui faut observer pour choisir les enzymes de restriction à utilisées?
SI les sites de restriction sont cohesifs entre eux
89
Quels sont les deux types de statégies dans le choix des enzymes?
- Statégie bidirectionnelle (1 enzyme)
- Stratégie unidirectionnelle (2 enzymes)
90
Qu'est-ce u'implique une stratégie bidirectionnelle?
- L'insert peut se coller dans les deux orientations possible dans le vecteur
- Le vecteur peut se refermer sur lui-même
91
Comment rectifier le problème de la stratégie bidirectionnelle?
Prendre des enzymes qui produisent des extrémités saillantes non cohesives entre elles de chaque côté du vecteur et de l'insert
92
Que doit contenir le SCM du vecteur choisi pour le clonage?
- Les deux sites différents présents aux extrémités de l'insert
- Ils doivent respecter l'orientation dictée par le promoteur et la transcription
93
Quels sont les deux combinaisons possible d'enzymes qui respectent l'orientation?
- PstI 5' et HindIII 3'
- PstI 5' et SalI 3'
94
Est-ce que le vecteur pUC19 contient les 3 enzymes des deux combinaisons qui respectent l'orientation?
Non, il n'y a pas HindIII dans le SCM
95
Est-ce que le vecteur pBluescript contient les 3 enzymes des deux combinaisons qui respectent l'orientation?
oui
96
Quel est le vecteur utilisé lors du laboratoire?
pBluescript
97
Comment se déroule la digestion et pendant combien de temps?
- Le vecteur et l'insert sont digéré séparément
- AVec les enzymes PstI et SalI
- Dure 2 à 16 heures
98
Comment faire la purification du fragment d'ADN obtenu?
- Migration sur gel d'agarose
- Identification des bandes car la taille du vecteur et de l'insert sont connues
- Découper la partie du gel du vecteur et de l'insert
- ADN extraite du gel et purifié
99
Comment liguer l'insert avec le vecteur?
Les incuber ensemble en présence de la ligase à ADN du phage T4, qui catalyse la formation de liaisons phosphodiester
100
Quelles sont les quantités nécessaire d'insert et de vecteur lors de l'incubation?
Plus grande quantité de molécules d'insert que de vecteur pour favoriser les réactions intermolculaire et augmenter les chances de réussite du clonage
101
Que fait-on avec le produit de ligation après l'incubation?
On l'utilise pour transformer la souche d'E. coli compétente DH5a
102
Comment peut-on vérifier la nature du plasmide inséré dans une bactérie?
Par séquençage de chaque colonie prélevée
