Práctica 10: qPCR Flashcards
(33 cards)
¿Cuál es la ventaja de la PCR frente a la qPCR?
Que tiene una mejor determinación de los tamaños de los productos de amplificación mediante electroforesis
¿Cuál es el objetivo de la q-PCR?
Determinar de forma rápida, precisa y económica la cantidad de moléculas presentes inicialmente en la muestra
¿Cuáles son las aplicaciones de la RT-qPCR?
El estudio de la expresión génica donde los cambios en los niveles de transcripción de varios ARNm se pueden comparar con un gen de expresión constitutiva
Se usa para el diagnóstico de la carga viral de un virus de ARN o diagnosticar enfermedades por perfiles de expresión
¿Cuáles son las aplicaciones de la qPCR?
El diagnóstico de enfermedades infecciosas determinando los niveles de patógenos específicos en varios tejidos
Detección de aneuploidías y otras enfermedades genéticas
Detectar y cuantificar contaminantes microbianos difíciles de cultivar
¿Cuántos ciclos son necesarios para que aparezcan amplicones en el gel de agarosa?
25-30 ciclos
¿Cuál es la fase de la PCR caracterizada por la disminución de dNTPs y cebadores?
Fase plateau o meseta
¿Cuál es la ventaja de la qPCR sobre la PCR?
La qPCR permite detectar y medir la acumulación del producto amplificado a medida que avanza cada uno de los ciclos de la reacción y determinar el número de copias inicial con alta precisión y sensibilidad
¿Cuándo se determina la cantidad de ADN molde original en una muestra en qPCR?
Examinando cada ciclo térmico inicial antes de alcanzar la meseta
¿A partir de que ciclo es detectable la fluorescencia?
+18 ciclos
¿Menor a 18 ciclos no hay fluorescencia?
Si la hay, pero no es detectable
¿Cómo se denomina el ciclo donde se acumula suficiente producto amplificado para producir una señal fluorescente detectable?
Ciclo umbral o Ct
¿Que condiciona que Ct sea mayor o menor?
Una menor cantidad de moléculas molde al inicio de la reacción hará que Ct sea mayor, y en caso contrario que haya mayor cantidad de moléculas al inicio condicionará una Ct baja
¿Cómo se clasifican los resultados arrojados por la qPCR?
En cuantitativos y cualitaticos
¿Cuál es el nombre del producto químico fluorescente cuya función es monitorear la amplificación de la secuencia blanco?
SYBR Green I
¿A que moléculas se une el SYBR Green?
A cualquier DNA de doble cadena
¿En una reacción de PCR convencional podemos directamente añadir SYBR Green?
Si, ya que no interrumpe a la DNA polimerasa
¿En que parte del ciclo de la PCR se lleva a cabo la recopilación de datos y en dónde?
Se hace en el termociclador para qPCR al final de cada ciclo de extensión
¿Cuáles son los pasos con los que consta cada punto de lectura en el termociclador?
Excitación
Emisión
Recolección
¿Cuál es la desventaja que podría tener el SYBR Green?
Es su falta de especificidad ya que puede unirse a cualquier ADN de doble cadena sin importar si es una amplificación específica o una inespecífica
¿Cómo podremos saber si nuestra PCR tuvo una ampliación inespecífica?
Mediante la electroforesis en gel o realizando una curva de desnaturalización
¿Cuál es el principio de la curva de desnaturalización?
Es que la temperatura aumenta desde una temperatura baja donde todas las moléculas son de doble cadena hasta una temperatura alta que provoca la desnaturalización de las hebras
¿Que pasa con la fluorescencia del SYBR Green si las cadenas se van desnaturalizando?
Disminuye considerablemente
¿De que factores depende la temperatura de fusión?
De la cantidad de GC y la longitud de la cadena
¿Que significa la Tm?
La temperatura a la cuál el 50% del DNA es bicatenario y el otro 50% se desnaturalizó en monocatenario
