Práctica 12: Mutagénisis dirigida Flashcards
(18 cards)
¿Que es el diagnóstico genético molecular?
El diagnóstico que estudia cambios en el genoma asociados a una enfermedad
¿Cómo se lee △F508?
Deleción de la fenilalanina en la posición 508
¿Qué es la fibrosis quística?
Una enfermedad autosómica recesiva que se caracteriza por la alteración de células epiteliales en diferentes órganos siendo el pulmón donde presenta más morbilidad y mortalidad
¿Cuál es la causa subyacente de la fibrosis quística?
Mutaciones en el gen que codifica para la proteína reguladora de la conductancia transmembranal de la FQ (CFTR)
¿Cuál es y en que consiste la mutación más frecuente que causa la fibrosis quística?
La deleción de los nucleótidos CTT del exón 11
Resulta en la pérdida del aminoácido fenilalanina en la posición 508
¿Cuál es y en que consiste la mutación que es menos frecuente que causa la fibrosis quística?
La deleción de un triplete de ATC que afecta la isoleucina 507
¿Qué es la mutagénesis dirigida?
Se refiere a una amplia variedad de técnicas que modifican la secuencia del DNA silvestre/original en regiones de longitud variable, pudiéndose tratar de incluso cambios puntales en un solo nucleótido
¿Cuántos enfoques tiene la mutagénesis dirigida y cuáles son?
2: Mutagénesis dirigida con enfoque de PCR y mutagénesis dirigida con enfoque de enzimas de restricción
En el enfoque PCR de mutagénesis dirigida ¿Cuántos cambios puede tener nuestro primer?
De 1 a 3
¿Que efectos tendría sobre la Tm el primer que modificamos de 1 a 3 secuencias?
Que la Tm disminuya ya que no van a hibridar completamente todas las bases
Como dato extra; por eso se requieren primers más largos para compensar a los nucleótidos que no hibridaron
Para el diagnóstico de △F508 ¿Que cambio va a tener nuestro primer?
Va a sustituir una C por una G
¿Cuál es la finalidad de que nuestro primer para el diagnóstico de △F508 tenga solo un cambio de C por G?
Al hibridar, va a generar un sitio de corte específico para la enzima de restricción Mbol que reconoce la secuencia GATC
¿Porqué la enzima de restricción solo hará el corte en el alelo sano y no en el mutante?
Porque al hibridar el primer con el alelo mutante, lo que va a hacer es generar una secuencia GATT mientras que si hibrida en el sano va a generar una secuencia GATC y como sabemos esta última es reconocida por la enzima de restricción
¿Cuál es la finalidad de incluir un control de la digestión?
Este control va ser un sitio de corte constitutivo (Tanto en el alelo sano como en el mutante aparecerá este corte alejado) lo que va a hacer es indicarnos si la enzima esta funcionando o no. Para evitar dar falsos negativos
Ahora que sabemos que nuestra enzima de restricción va a hacer el corte SOLO en el alelo sano ¿Cómo se verá cuando corramos ambos alelos en la electroforesis?
Como el alelo mutante no se cortó, tendrá un peso molecular mayor y por eso aparecerá una banda más superior que la banda que genera el alelo sano que sí se cortó
En la electroforesis ¿Cuál es el peso molecular que tendrá nuestra banda producida por el alelo sano y el alelo mutante
El alelo mutante tendrá 215 pb y el sano tendrá 201 pb
Si mencionamos que la △F508 produce una deleción en CTT ¿Cómo es que afecta a la fenilalanina de la posición 508 pero no a la isoleucina de la posición 507?
Porque el codon para la fenilalanina es TTT por eso al quitarle 2 T (Recordemos que la deleción es CTT) va a quedar solo una T
Al contrario a la isoleucina quitarle una C a su codón ATC lo que hará es recorrerse la T que sobró del aminoácido perdido de la posición 508 quedando ATT y nos damos cuenta que este codón también codifica para isoleucina
¿Por qué la mutación △F508 no puede ser diferenciada de la mutación △I507 usando el primer Fwd-Mut?
Porque el primer solo va a generar el sitio de corte específico en el alelo sano y tanto en el alelo mutante △F508 y el alelo mutante △I507 no habrá corte
