Práctica 11: Diseño de primers Flashcards
(16 cards)
¿Qué es un primer?
Un oligonucleótido corto de cadena sencilla complementario al DNA diana que provee un extremo 3’OH libre a la DNA polimerasa
¿Cuánto miden los primers?
Usualmente de 18 a 25 nt
¿Es lo mismo diseñar primers para PCR que para qPCR?
Si
¿Que regiones no debemos usar para el diseño de primers?
Partes de los cromosomas que puedan compartir cierta similitud de nucleótidos debido a regiones homólogas o coincidencias fortuitas
Además de las regiones homólogas o con coincidencias fortuitas ¿Que otras regiones no debemos utilizar para hacer un primer y porqué?
Regiones que tengan un polimorfismo de nucleótido sencillo ya que pueden dar lugar a ampliaciones inespecíficas
¿Que falta de complementariedad del primer es más perjudicial para la especificidad de amplificación?
Una falta de complementariedad 3’ ya que si no hibrida, no le puede brindar a la DNA polimerasa el extremo 3’OH
Teníamos claros que la Tm en la fase de desnaturalización del ciclo de la PCR indicaba cuando 50% del DNA era monocatenario y 50% bicatenario pero ¿Que significa la Tm en los primers?
La temperatura a la que hibridan los primers estableciendo todos los puentes de hidrógeno con el DNA molde
Esta temperatura la determina la longitud del primer y la cantidad de GC
¿Qué es la auto complementariedad?
La probabilidad de que un primer se una a sí mismo y al otro cebador en cualquier punto a lo largo de su secuencia
Forma estructuras secundarias de horquilla o tallo-burbuja
En el PCR template ¿Cómo podemos señalar la secuencia de DNA que queremos amplificar?
Tenemos dos opciones: la secuencia de referencia del NCBI (RefSeq) o el formato FASTA, el primero es más confiable porque es menos propenso a errores
¿Qué es la auto complementariedad 3’?
La probabilidad de que el primer se una a sí mismo y al otro en el extremo 3’OH formando dímeros de primers
¿Cómo escribimos una secuencia en formato FASTA?
> (Descripción de una sola línea)
(Líneas de datos de secuencia)
Si vamos al cine ¿Se debería comprar en dulcería?
No, es más recomendable comprar primers 👍
¿Que podemos ajustar en Primer Parameters?
Verificar la especificidad
Determinar la longitud del producto amplificado
- El número de primers que deseamos
- Tm deseada
¿Cuál es la finalidad de abarcar un intron o colocarse entre exones un primer para RT-qPCR?
Para evitar la amplificación no deseada de DNA genómico
¿Cuáles son los valores máximos de auto complementariedad y auto complementariedad 3’ que sean mejores para el diseño de primers?
8.0 y 3.0
Recordemos que debe ser mucho menor para la auto complementariedad 3’
¿Los amplicones son los mismos para PCR que para qPCR?
No, por lo general se prefieren amplicones más cortos en qPCR para poder hacer mejor el análisis
