Aplicaciones de los microarreglos Flashcards
(23 cards)
qué son los microarreglos?
”Metodología que permite la identificación de moléculas de ADN o ARN mediante la hibridación en una estructura de vidrio o silicona”
fundamento de los microarreglos
- Hibridación de AN por el principio de complementariedad
- Detección por fluorescencia (BN marcadas)
- Se obtiene la señal donde haya hibridación
- Permite la lectura de miles de variantes en un solo ensayo
funcionamiento de los microarreglos
- Distribución ordenada de oligonucleotidos sobre un portaobjetos de sílice o silicona
- Se agregan fragmentos de DNA derivados de librerías a los oligonucleotidos y se pegan por hibridación
- Variantes se analizan de manera simultánea y se observan resultados por fluorescencia
qué son los oligonucleótidos?
secuencias específicas de 15-25 nt sintetizadas en un laboratorio
pasos para generar librerías para microarreglos
- Extracción de DNA de células del organismo a estudiar
- Digestión controlada de un gen por medio del corte de enzimas de restricción
- Generación de fragmentos de restricción de distinto tamaño que se traslapan
- Unión del gen específico
tipos de microarreglos
- DNA
- RNA
- Metilación
- Proteínas
cómo son los microarreglos de DNA?
SNPs — se detectan variantes genéticas especificas, son útiles porque están en todo el genoma
cómo son los microarreglos de RNA?
análisis de la expresión génica en tejido y tiempo específicos, se extrae el RNA y se retrotranscribe a cDNA porque el RNA es muy inestable
cómo son los microarreglos de metilación?
CpG — análisis y comparación de sitios de metilación
cómo son los microarreglos de proteínas?
análisis de proteínas mediante el uso de anticuerpos específicos
Características de los Microarreglos de DNA (SNPs CHIP)
- En cada celda hay un oligonucleotido especifico para cada SNPs, y cada oligonucleotido tiene un fluoroforo diferente
- Permite analizar hasta 50,000 variantes
- Caracterizar genotipos y polimorfismos bialelicos (medir heterocigoto y homocigoto)
uso de los microarreglos de DNA en medicina forense y ciencias de la salud
forense: generar un perfil genético mediante la ampliación de polimorfismos SNPs
ciencias: análisis de polimorfismos en enfermedades metabólicas
para qué nos sirven los micorarreglos de RNA?
-
Análisis comparativos entre perfiles de expresión de
a) células sanas vs px enfermo
b) px 1 vs px 2
c) condiciones A vs B - Identificación de rutas metabólicas implicadas en enfermedades (ej. cancer)
- Caracterizar expresión mediante niveles de florescencia (medir cantidad de cDNA) (mayor fluorescencia = mayor expresión del gen)
pasos de los micorarreglos de RNA
- Extracción de RNA en tiempo y tejido específico
- Retrotranscripcion y amplificación del cDNA
- Adherencia del cDNA al microarreglo
- Mismo principio de hibridación
aplicaciones de microarreglos de RNA en medicina
— Microbiología: estudios de patogenicidad y resistencia bacteriana
— ciencias de la salud: análisis comparativo entre tejidos y células sanas-enfermas
— Posibles aplicaciones: dx temprano, estudios de nuevos
fármacos, cáncer, guías de tx
cómo son los microarreglos de proteínas?
En lugar de usar oligos se usan anticuerpos
cómo es la metilación en los microarreglos?
transferencia de grupos metilo al C 5 de las citocinas de islas CpG para silenciar/inactivar genes
cuál es el donante de metilos en los micorarreglos por metilación?
S-adenosil metionina
características de microarreglos de metilación
- Mediado por DNA metiltransferasas
- asociado a cáncer
- Identificación de islas CpG metiladas y no metiladas mediante el uso de oligos que tienen sitios específicos de islas CpG
Human Methylation 4500 Beadhcip (Illumina)
Human Methylation 4500 Beadhcip (Illumina)
* Síntesis de oligos que cubren 99% de genes referenciados en el PGH y 250,000 islas CpG
infinium 1 vs infinium 2 del Human Methylation 4500 Beadhcip (Illumina)
- Infinium 1: Tiene pozos separados para regiones metiladas y no metiladas.
- Infinium 2: roja las regiones no metiladas y verde las metiladas.
cómo se marca que no está metilada una región en El Human Methylation Beadchip?
La enzima disulfito reconoce regiones NO metiladas y reemplaza la BN (C) por una T marcada por un fluoroforo rojo
cómo se marca que sí está metilada una región en El Human Methylation Beadchip?
disulfito no reconoce regiones metiladas
marca la BN (A, G, C) con un fluoroforo verde
