ExG5 - Transcription eucaryote gènes de classe 2

Question 1

Généralités

Answer 1

• L’ARN polymérase II (ARN pol II) est responsable de la transcription d’environ 25.000 à 30.000 gènes chez les eucaryotes, principalement ceux codant pour les ARN messagers (ARNm).
• Elle possède une activité très processive, capable de transcrire jusqu’à 1 million (10^6) de paires de bases sans se dissocier de l’ADN matrice, ce qui est essentiel pour la synthèse efficace des longs transcrits d’ARNm [[140]].

Question 2

Structure et fonctionnement de l’ARN polymérase II

Answer 2

• L’enzyme est un complexe protéique multi-sous-unités, dont les principales sont Rpb1 et Rpb2, homologues des β’ et β des ARN polymérases bactériennes.
• La pince formée par des parties de Rpb1 (β’ like) et Rpb2 (β like) maintient l’ADN matrice et le transcrit ARN dans le complexe pendant la transcription.
• Le site actif contient des ions Mg^2+ nécessaires à la catalyse de la polymérisation.
• L’hélice dite de pontage (« bridge ») traverse le sillon de l’enzyme et relie Rpb1 à Rpb2, participant à la stabilité et au positionnement du transcrit [[140]].

Question 3

Domaine C-terminal (CTD)

Answer 3

• Une caractéristique unique et essentielle de l’ARN pol II est le domaine C-terminal (CTD) de la sous-unité Rpb1.
• Ce domaine est constitué d’une répétition multiple (52 répétitions chez l’Homme) d’un héptapeptide consensus : Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser.
• Le CTD est non phosphorylé dans la forme ARN pol IIA (étape d’initiation) puis devient hyperphosphorylé dans la forme ARN pol IIO lors de l’élongation.
• La phosphorylation des résidus Ser (notamment Ser2 et Ser5), ainsi que d’autres modifications comme la glycosylation (ajout d’O-GlcNAc) et l’isomérisation cis/trans des prolines (via PPIases), régulent le cycle de vie de l’ARN pol II et le recrutement des facteurs associés à chaque étape de la transcription [[141-142]].

Question 4

Rôle fonctionnel du CTD

Answer 4

• La phosphorylation dynamique du CTD agit comme un code qui contrôle le recrutement séquentiel de nombreux complexes protéiques nécessaires à la transcription et au traitement de l’ARN.
• Parmi les protéines recrutées au CTD, on trouve :
  
  • Les facteurs généraux de transcription (ex. TBP, TFIIF, TFIIE),
  • Le complexe médiateur, qui sert de pont entre les activateurs transcriptionnels et l’ARN pol II,
  • Les enzymes de coiffe (guanylyl-transférase) pour la modification 5’ de l’ARNm,
  • Les facteurs d’élongation,
  • Les machineries d’épissage (pour enlever les introns),
  • Les enzymes de polyadénylation et de terminaison (formation de la queue polyA en 3’).
• Ce recrutement coordonné permet une transcription efficace couplée au traitement co-transcriptionnel de l’ARNm [[143-144]].

Question 5

Mécanisme d’action et inhibition

Answer 5

• L’ARN pol II dénature localement l’ADN pour former une bulle de transcription et incorpore les premiers nucléotides par complémentarité basique avec le brin matrice d’ADN.
• L’enzyme passe par différentes conformations (complexe fermé, ouvert, élongation) au cours de l’initiation et de la synthèse.
• Elle possède aussi une activité correctrice intrinsèque, capable de relancer la transcription après des pauses ou erreurs, notamment via le facteur TFIIS.
• Inhibiteurs spécifiques de la transcription par ARN pol II existent et sont utilisés en recherche et en médecine :
  
  • α-amanitine, toxine produite par l’Amanite phalloïde, est un puissant inhibiteur de l’ARN pol II (bloque initiation et élongation).
  • Actinomycine D se lie à l’ADN au niveau du complexe d’initiation, empêchant la progression de l’ARN pol II, et peut aussi interférer avec la réplication d’ADN. Elle est utilisée comme agent anticancéreux [[140]].

Question 6

A. Le core promoteur et ses éléments cis

Answer 6

Le core promoteur est une séquence d’ADN située en amont du site de départ de la transcription (+1) qui sert de plateforme pour l’assemblage des protéines nécessaires à l’initiation de la transcription.

Il contient plusieurs éléments cis, c’est-à-dire des séquences spécifiques reconnues par des protéines, notamment :

• TATA box : une séquence riche en thymine et adénine, présente dans certains promoteurs, qui sert de site de fixation pour la protéine TBP (TATA box Binding Protein). Elle induit une courbure importante de l’ADN (~80°) facilitant l’assemblage du PIC.
• BRE (TFIIB Recognition Element) : une séquence reconnue par le facteur TFIIB, stabilisant l’interaction avec TBP.
• Inr (Initiator) : l’élément le plus commun, souvent associé à la TATA box ou au DPE.
• DPE (Downstream Promoter Element) : présent dans les promoteurs sans TATA box (TATA-less), il agit en coopération avec l’Inr.
• DCE (Downstream Core Element) et MTE (Motif Ten Element) : éléments supplémentaires qui stimulent la transcription en collaboration avec Inr et DPE.

Ces éléments se combinent de manière variable selon les gènes pour réguler finement l’initiation de la transcription [[146]].

Question 7

B. Facteurs généraux de transcription (GTF)

Answer 7

Les GTF sont des protéines essentielles qui s’assemblent sur le core promoteur pour former le complexe de pré-initiation (PIC) et recruter l’ARN polymérase II. Les principaux GTF sont :

• TFIID : complexe formé de la TBP (TATA box Binding Protein) et de plusieurs TAFs (TBP Associated Factors).
  
  • La TBP se lie au TATA box en insérant un feuillet β dans le petit sillon de l’ADN, induisant une courbure d’environ 80°.
  • Les TAFs reconnaissent d’autres éléments promoteurs comme l’Inr et le DPE, et peuvent jouer un rôle dans la régulation spécifique des gènes, y compris la spécificité cellulaire.
• TFIIA : se lie à TBP et à l’ADN, stabilisant TBP et agissant comme co-activateur. Il empêche également la liaison de répresseurs.
• TFIIB : se fixe au BRE en présence de TBP, stabilise l’interaction TBP-ADN, participe au choix du site d’initiation et recrute le complexe TFIIF-ARN polymérase II.
• TFIIF : composé de deux sous-unités, il stabilise la position correcte de l’ARN polymérase II au promoteur, facilite l’enroulement de l’ADN autour de la polymérase, stimule l’élongation, et participe au dégagement du promoteur. Il possède aussi une activité kinase.
• TFIIE : formé de deux sous-unités, permet le recrutement de TFIIH et stimule ses activités hélicase et kinase. Impliqué dans l’ouverture du promoteur et le dégagement du complexe initial.
• TFIIH : complexe multi-sous-unités avec plusieurs activités clés :
  
  • XPB : hélicase 3’→5’, essentielle pour ouvrir le promoteur et permettre l’accès de l’ARN polymérase.
  • XPD : hélicase 5’→3’, impliquée dans la réparation de l’ADN et la stimulation de la transcription.
  • Des kinases qui phosphorylent le domaine CTD de la sous-unité Rpb1 de l’ARN polymérase II, un événement crucial pour la transition de l’initiation à l’élongation.
  • TFB5 : une protéine nécessaire au recrutement de TFIIH au promoteur.

Ces facteurs interagissent étroitement pour former un complexe stable et fonctionnel capable d’initier la transcription de manière efficace [[147]].

Question 8

C. Assemblage progressif du complexe de pré-initiation (PIC)

Answer 8

• Le PIC se forme de manière ordonnée :
  
  1. TFIID (TBP + TAFs) se lie d’abord au core promoteur. La TBP plie l’ADN, facilitant la formation du complexe.
  2. TFIIA et TFIIB se fixent, stabilisant la liaison de TFIID à l’ADN.
  3. Le complexe ARN polymérase II associé à TFIIF est recruté et positionné correctement au site d’initiation.
  4. TFIIE est ajouté, permettant le recrutement de TFIIH.
  5. TFIIH, grâce à son activité hélicase, ouvre localement l’ADN pour former la bulle de transcription.
  6. La kinase de TFIIH phosphoryle le domaine CTD de l’ARN polymérase II, déclenchant le passage à l’élongation.

Cette organisation ordonnée assure que la transcription démarre avec précision et régulation fine [[148]].

Question 9

11.1 Initiation de la transcription

Answer 9

• Formation du complexe de pré-initiation (PIC) :
  La transcription débute par l’assemblage progressif du PIC au niveau du promoteur du gène. Ce complexe comprend l’ARN polymérase II et les facteurs généraux de transcription (GTF), notamment TFIID (qui contient la TBP), TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, et TFIIH. La TBP (TATA-binding protein) se fixe à la boîte TATA (si présente), provoquant une déformation de l’ADN (courbure d’environ 80°) qui facilite la fixation des autres facteurs et de l’ARN pol II [[148]].
• Ouverture locale de l’ADN :
  L’activité hélicase de TFIIH (sous-unités XPB, XPD) ouvre la double hélice d’ADN au niveau du promoteur, formant une « bulle de transcription » où le brin matrice est exposé pour servir de modèle à la synthèse d’ARN [[147, 149]].
• Incorporation des premiers nucléotides :
  L’ARN polymérase II commence à synthétiser l’ARN en incorporant les premiers ribonucléotides complémentaires au brin matrice. Une courte région d’hybride ARN-ADN de 8 à 9 nucléotides est formée dans le site actif de l’enzyme [[149]].
• Phosphorylation du domaine C-terminal (CTD) :
  Le CTD de la sous-unité Rpb1 de l’ARN pol II, comportant 52 répétitions d’un héptapeptide, est non phosphorylé au départ (ARN pol IIA). Lors de l’initiation, il est phosphorylé (par exemple sur les résidus de sérine 5) par la kinase associée à TFIIH, ce qui provoque le dégagement des facteurs généraux de transcription et permet la transition vers l’élongation [[141-144,149]].
• Dégagement du promoteur :
  La polymérase « échappe » au promoteur, c’est-à-dire qu’elle dépasse la région du promoteur et se positionne pour l’élongation. Les facteurs généraux de transcription sont partiellement ou complètement relâchés, et de nouveaux facteurs d’élongation se joignent au complexe [[149]].

Question 10

11.2 Élongation de la transcription

Answer 10

• Stabilisation du complexe et synthèse de l’ARN :
  Pendant l’élongation, l’ARN polymérase II se déplace le long de l’ADN matrice, allongeant le transcrit ARN. La bulle de transcription se déplace avec la polymérase, maintenant environ 12 à 14 nucléotides d’ARN hybridés à l’ADN [[150]].
• Recrutement de facteurs d’élongation :
  Plusieurs protéines et complexes se lient à l’ARN pol II phosphorylée au CTD, facilitant le processus d’élongation. Parmi eux, on trouve des facteurs positifs (comme P-TEFb) et négatifs (comme NELF) qui régulent la vitesse et la progression de la polymérase [[150]].
• Facteurs négatifs et positifs :
  
  • NELF (Negative Elongation Factor) peut provoquer une pause de la transcription en se liant au complexe transcriptionnel.
  • P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b) phosphoryle la sérine 2 du CTD et les composants de NELF, entraînant la dissociation de NELF et la reprise de l’élongation.
• Correction de l’ARN :
  Le facteur TFIIS intervient pour relancer la polymérase lorsqu’elle est bloquée ou en pause, stimulant aussi son activité exonucléolytique correctrice, permettant un contrôle qualité du transcrit en cours d’élongation [[150]].

Question 11

11.3 Terminaison de la transcription

Answer 11

• La terminaison de la transcription par l’ARN pol II est un processus complexe et encore sujet à des modèles explicatifs.
• Modèles proposés :
  • Modèle d’encombrement stérique : La polymérase rencontre des obstacles physiques ou des structures qui favorisent sa dissociation de l’ADN.
  • Modèle Torpedo (ou torpille) : Après clivage du transcrit pré-messager en 3’ (en aval du signal de polyadénylation), une exonucléase (comme Rat1 chez la levure, hXrn2 chez l’humain) dégrade le fragment d’ARN restant attaché à l’ARN pol II. Cette dégradation en 5’→3’ « rattrape » la polymérase et provoque sa dissociation du brin d’ADN, terminant ainsi la transcription [[151]].

Question 12

Résumé schématique

Answer 12

1. Initiation : Assemblage du PIC, ouverture de l’ADN, début de synthèse de l’ARN, phosphorylation du CTD, dégagement du promoteur.
2. Élongation : Synthèse continue de l’ARN, régulation par facteurs positifs (P-TEFb) et négatifs (NELF), correction par TFIIS.
3. Terminaison : Clivage du pré-ARNm, dégradation du fragment restant par exonucléases (modèle torpille), dissociation de l’ARN pol II.